黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素基因的时空表达、调控及其对肌肉生长的调节作用

本项目拟以裂腹鱼亚科鱼类广布种-黄河裸裂尻鱼为研究对象，针对其生长期短、生长速度缓慢的典型生物学特性，采用分子生物学、细胞生物学等技术手段，获得黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素（MSTN）基因全长cDNA和启动子序列；构建MSTN全长编码区及前肽真核表达质粒；确定MSTN基因启动子的转录调控活性元件；取得MSTN基因沉默或抑制表达与成肌细胞增殖和分化关系的相关数据，其目的在于确定黄河裸裂尻鱼MSTN基因及其编码蛋白的结构特征，探讨MSTN基因在典型高原冷水鱼中的表达规律，揭示MSTN 基因的表达调控方式及其在肌肉生长发育中的作用机理，为突破高原冷水鱼类生长缓慢的瓶颈、推动高原土著鱼类的资源保护、人工繁殖和新型育种提供科学依据。同时，也为阐明肌肉分化、生长、发育的机制和调控原理，治疗肌肉损伤、肌肉萎缩或肌肉肥大等相关疾病提供理论和实验依据。

肌肉生长抑制素 (myostatin, MSTN) 是转化生长因子β（TGF-β）超家族中的一个新成员，对骨骼肌的发育和生长具有负调控作用。MSTN基因的敲除、沉默或抑制表达将引起动物肌细胞增生和肌纤维的肥大，从而增加动物肌肉生长量。黄河裸裂尻鱼是裂腹鱼亚科鱼类的代表种，具有生长期短、生长缓慢、性成熟迟、繁殖力低等的典型生物学特性。本项目获得了黄河裸裂尻鱼MSTN基因全长cDNA，分析其基因结构和蛋白三维空间结构；结合黄河裸裂尻鱼的人工繁殖，探究MSTN基因在胚胎不同发育阶段和生长期的时空表达特征；构建MSTN前肽序列真核表达质粒及并开展HeLa细胞表达和活体瞬时转录研究；构建MSTN成熟肽原核表达质粒，并制备抗体；构建RNA干扰重组腺病毒，并开展MSTN基因体外和活体干扰的效率评价，及其对肌肉生长的影响；探讨了MSTN基因干扰后对下游3个基因的表达调控作用；从转录组水平扫描了包括黄河裸裂尻鱼在内的裂腹鱼亚科鱼类MSTN基因的旁系同源基因；系统开展了裸裂尻鱼属的系统进化和生物地理学研究。研究成果为了解MSTN的基因结构、功能和表达调控积累了科学数据。主要结果如下：（1）黄河裸裂尻鱼受精卵在水温8.6～14.5℃，经11天孵化破膜，孵化积温为158.2℃•d；（2）黄河裸裂尻鱼MSTN基因全长cDNA序列为2180 bp，包括2个内含子和3个外显子，其开放阅读框长1128 bp，编码375个氨基酸。编码蛋白包含两端保守区域：TGF-β前肽区域(41~257 bp)和TGF-β功能区域(278~375 bp；（3）MSTN基因在黄河裸裂尻鱼组织中广泛表达，但在心、肾、肠、精巢中表达量较高；在胚胎中的相对表达量随胚胎发育阶段的不同而有所差异，暗示MSTN的功能可能并不局限在对肌肉生长发育的负调控作用；（4）成功构建shRNA重组腺病毒载体，在活体中获得良好的MSTN干扰效率。随着MSTN基因表达的下降，下游基因MCK表达显著上调，但MYOD和Mrf4表达随之下降，肌肉生长量有所增加，但统计检验不显著；（5）转录组学研究证实裂腹鱼亚科鱼类拥有2个MSTN旁系同源基因（MSTN1和MSTN2），但是否具有相同的生物学功能有待验证；（6）自4.5百万年以来，青藏高原的隆升和水系的演化促进了裸裂尻鱼属鱼类的隔离和分化，黄河裸裂尻鱼是晚期演化形成的高原特有种。