中医寒热痹方证相应的表观遗传学机制研究

According to TCM, rheumatoid arthritis (RA) is rheumatism at first, then changed to moist heat, and this is similar to modern medicine. Many studies support that epigenetic response is definitive in RA progressing, especially for miRNA expression and DNA methylation in RASFs- - - - - - a response to pathogenic factor and disease course at gene level. Both Wutou Decoction and Baihuguizhi Decoction are classic formulae in treating Hanrebi symptom, but the epigenetic mechanisms underlying them remain unclear. In this study, we propose that the differences between Hanbi symptom and Rebi symptom are determined by miRNA expression and DNA methylation in RASFs, the classic formulae ameliorate the injuries caused by disease course and environment, then exhibit therapeutic effect. We will study the epigenetic mechanism underlying the effects of environment and disease course on Bi syndrome progression and treatment with classic formulae in adjuvant arthritis rat by the way of quantitative mRNA and DNA methylation array to explore the biological basis of "same disease while different syndrome" from the point of environment, personality and formulae combination.

中医认为类风湿性关节炎（RA）"早期风湿居多，中期湿热为主"，与"慢性侵蚀性炎症……逐渐导致……"等现代认知类似；目前认为表观遗传应答在RA疾病的转归中有（起）着决定性作用，其中以滑膜成纤维细胞(RASFs)miRNA表达和DNA甲基化最为突出，是基因层面机体对致病因素和病程时长的应答。乌头汤和白虎加桂枝汤是治疗寒热痹症的经典名方，但缺乏表观遗传学机制的研究。本研究在前期研究及文献分析基础上，形成了"寒痹"与"热痹"的证型差异由表观遗传因子RASFs miRNA表达和DNA甲基化所标定，方证相关经方可修复时（病程）空（环境）因素对表观遗传的错误调控，最终实现有效的治疗效果"的工作假说。拟采用成熟可靠的mRNA定量及DNA甲基化生物芯片技术，以佐剂型关节炎大鼠为研究对象，研究寒热环境与病程时长对痹证行进、转归及经方治疗的表观遗传学机制，从环境、个体和方剂结合的角度揭示"同病异证"生物学基础。

本项目以寒、热痹差异性表观遗传因子及对证经方乌头汤和白虎加桂枝汤为研究对象，选择佐剂性关节炎大鼠模型，并在此基础上制备寒痹与热痹模型。采用MeDIP-Seq测序方法及qRT-PCR实验技术，探讨了寒湿与湿热环境对痹证行进、转归及经方治疗痹证的生物学表观遗传学机制。.研究发现，寒湿与湿热环境的甲基化基因共同通路主要与细胞间信号转导相关，如钙信号转导途径，而差异性通路主要与免疫炎症及物质代谢相关，如抗原提呈和处理、磷酸肌醇代谢等。以取空白组Vs. 寒痹模型组和空白组Vs. 佐剂性关节炎模型组甲基化基因差集的方法，及空白组Vs. 热痹模型组和空白组Vs.佐剂性关节炎模型组甲基化基因差集的方法，得到30个寒湿，50个湿热特征性甲基化基因，其中甲基化下调基因Ahcy与上调基因Ears2和Pgk1为两种环境共有甲基化基因，其功能主要与代谢相关。寒湿特征性甲基化基因的功能主要与代谢，如氨基酸代谢，细胞信号转导，如G-蛋白偶联受体信号传导、基因转录等功能相关，而湿热主要与炎症免疫反应，如NF-κB信号通路，体内代谢，如琥珀酸代谢等相关。其中与代谢相关的基因，寒湿甲基化基因主要表现为甲基化上调，而湿热甲基化基因表现为甲基化下调。根据基因功能及reads倍率大小，筛选环境特征性甲基化基因进行验证，与免疫炎症相关基因Ahcy、Lamp1、Stat2及Tank，其甲基化水平与基因表达水平相反，而与代谢相关基因除Ears2外，Lbr、Pgk1及Agxt也呈相反关系。经方干预后，乌头汤抑制与白细胞迁移和自噬相关的甲基化下调基因Lamp1的表达，提高与糖代谢相关甲基化上调基因Pgk1的表达，而白虎加桂枝汤抑制与IL-4信号途径及巨噬细胞活性相关甲基化下调基因Rpl3的表达，提高与氨基酸代谢相关甲基化上调基因Agxt的表达，此外对寒湿与湿热环境共同甲基化基因Ahcy，乌头汤与白虎加桂枝汤临床给药剂量下呈相反调控作用。综上所述，本项目从本研究从环境、个体和药物三结合的角度揭示中医学同病异证的生物学基础和经方的治疗作用，可为方剂理论及中药抗炎免疫研究提供新方法与新思路的借鉴。