剪切敏感型霉菌的理性选育和形态塑造及其在发酵中的应用

The common strategy for fermentation optimization of shear-sensitive filamentous fungus is to modify and redesign a specific bioreactor, which means the bioreactor should be adapted to the different microorganism. However, the drawback of this strategy is evident. First, the specific agitator or bioreactor is always expensive, which increase the investment of equipment. Second, the specific bioreactor is normally very rare and not always available, which brings much inconvenience for the academic research, pilot test and scale-up study.. This proposal aims to improve the filamentous fungus to adapt to the widely-used common bioreactor by genetic breeding, instead of modifying the bioreactor. On the premise of unchanging the biosynthetic pathway of the second metabolites, the homologous genes related to the polarized growth, hypha-specific growth of dimorphism, and cell wall architecture will be deleted to modify the mycelial morphology and elastic properties of the cell wall of filamentous fungus.. Thus, a new strategy of shaping the morphology of mould rationally will be developed and to decrease the shear-sensitivity of mould. This strategy is one of the potential ways to reduce engineering cost, shorten time of pilot test and scale-up study, and solve the problem of fermentation of the shear-sensitive mould.

对剪切敏感型微生物的发酵，常规的思路是对反应器进行改造，使反应器适应微生物。但该思路的局限性也是显而易见的：即这些非常规的搅拌桨和反应器价格昂贵，导致设备投资大；另一个问题是这样的特殊反应器数量很少，给科研、中试、放大等带来了很大的不便。.本课题拟不改造反应器，仍旧使用普通、经济的发酵罐，而是改造微生物。即在不改变次级代谢途径的前提下，在剪切敏感型霉菌中敲除极化生长基因和两态菌中菌丝形成特异性基因的同源基因，使之形成不同形态的菌丝或形成类似酵母的形态，并对细胞壁厚度和弹性进行调控，实现对霉菌菌株形态的理性选育和重新塑造。由此形成的剪切不敏感菌株，可望在发酵工艺放大中保证活性代谢物的产量，降低对于发酵设备的特殊要求，缩短发酵中试和放大的研发周期，解决剪切敏感型霉菌的发酵工程问题。

本课题将霉菌菌丝形态调控分子机制的新进展应用到微生物遗传育种中，在不改变次级代谢途径的前提下，从基因的角度，对菌丝极化生长、菌丝及细胞壁形成进行改造，使之形成不同形态的菌体形态，增强菌体耐剪切能力及降低发酵液粘度。克隆得到灰绿曲霉极化生长相关的驱动蛋白AgKipA和地标蛋白AgTeaA、AgTeaR的基因序列，以Sh ble作为筛选标记，分别对AgKipA和AgTeaR两个基因进行了敲除。缺失株菌丝形态出现了不同程度的弯曲，分生孢子萌发的方式也发生了相应的改变，但生长速率和发育没有受到影响。缺失AgKipA后，菌丝极易形成致密的菌球状，降低了反应器中的发酵液粘度，宏观剪切环境，提高了氧传递能力，最终使灰绿霉素A产量达到121.7 mg/L，相对于野生株提升了82.2%。克隆得到灰绿曲霉细胞壁生长相关的基因AgugtA，AgugmA，AgugeA，并使用Sh ble作为筛选标记对上述基因进行敲除，然而，数百株转化子经验证皆为随机插入株。针对AgugeA基因，添加蛋白抑制剂苯甲酰甲醛，菌体全部被杀死，而对照菌构巢曲霉未表现出明显的生长抑制，推测AgugeA基因可能是必需基因。多次基因沉默实验均无转化子长出，进一步证明该基因的缺失对灰绿曲霉是致死的。克隆得到霉菌两态性基因同源基因Agseb1 ，该基因的缺失利于菌丝体的分叉并延缓菌落生长，摇瓶及反应器液体发酵实验证实，该基因缺失株的菌丝团和分散菌丝簇的形态与野生型无明显差异，且各项指标趋势较一致，但最终产量却比野生株低68%，说明该基因除影响形态外，很可能从不同层面影响细胞代谢。探索了细胞周期蛋白和特殊锌指蛋白对构巢曲霉的形态发育的影响，构建了7个基因缺失株，细胞周期蛋白编码基因Cln1、Cln4、Cln5和Cln6与菌体无性生殖过程中分生孢子的生成有关，且对温度的敏感增加，对菌丝形态影响不大。本课题研究结果证实了不改造反应器，仍旧使用最普通、最经济的涡轮桨发酵罐，而是改造微生物以缓解剪切敏感问题的可行性，这对霉菌及放线菌发酵中降低工程成本，缩短发酵中试和放大的时间消耗，解决发酵工程的问题等提出了一种新的可行的思路。