基于SFK-VEGF转导通路补青颗粒对大鼠晶状体氧化应激的保护作用及机制研究

Age related cataract（ARC）is still a main disease of growing blind in our country,which main presentation is the degeneration of the lens opacity,however,the pathogenesis is not yet clear. Oxidative stress induced by reactive oxygen species has long been implicated in senile cataract formation. It has been known that not only Src-family kinase (SFK) but also Vascular endothelial growth factor (VEGF) played important roles in cell adhesion, proliferation, process migration, differentiation and apoptosis.SFK involved in the differentiation of lens fiber. The latest researches show that it is also vital to the crystalline lens which is absence of blood vessels. Activating SFK/VEGF has take part in the cataract lenses of oxidative damage .Based on the earlier stage of clinical observations and animal experiments, in order to clarify the effects of Buqing granules,our study will observe Buqing granules efficacy by organ model and cell model. Using the molecular biology techniques and confocal laser, we observe the molecular metabolism that Buqing granules whether can regulate SFK/VEGF signaling pathway to prevent the cataract lenses of rats from oxidative stress damage in the organ-cell-molecular level.

年龄相关性白内障（age-related cataract，ARC）在我国致盲疾病中位居首位，其最主要表现为晶状体变性浑浊，虽其发病机制尚未完全阐明，但氧化应激损伤已被认为是白内障最重要的始发因素。Src-家族酪氨酸激酶（SFK）和血管内皮生长因子（VEGF）在细胞黏着、增殖、迁移、分化和凋亡等过程中都起到重要调控作用，SFK参与了晶状体纤维的分化，且最新研究表明，在无血管存在的晶状体中VEGF一样发挥着重要的作用，SFK/VEGF通路的激活参与了氧化应激致晶状体细胞损伤的过程。在前期临床观察和动物实验基础上，为阐明补青颗粒对大鼠晶状体氧化应激损伤的作用机制，本课题拟分别通过氧化应激诱导器官损伤模型和细胞损伤模型，运用分子生物学、激光共聚焦等先进技术手段，从器官-细胞-分子水平，观察补青颗粒调控SFK-VEGF信号转导通路，干预大鼠晶体状氧化应激损伤的作用及机制。

目的：通过观察补青颗粒对大鼠晶状体透明度等指标和抗氧化酶（TTase和Trx）的影响，在器官-分子水平上进一步阐明补青颗粒抗大鼠晶状体氧化应激损伤的作用。通过观察补青颗粒对大鼠晶状体及晶状体上皮细胞（LEC）SFK-VEGF通路的影响，在器官-细胞-分子水平上阐明补青颗粒保护大鼠晶状体氧化应激损伤的相关分子机制。方法：应用中药血清药理学方法，制备补青颗粒（BQ）含药血清、阳性对照药杞菊地黄丸（QJ）含药血清及空白血清（CON）。离体培养大鼠晶状体，复制H2O2诱导的大鼠晶状体氧化应激模型。再分别给予含药血清及空白血清干预，观察BQ对大鼠晶状体的浑浊程度、对晶状体蛋白热稳定性的影响并对大鼠晶状体抗氧化酶（TTase和Trx）含量分析。观察指标：晶状体混浊度、晶状体蛋白热稳定性、晶状体抗氧化酶含量。观察指标：蛋白表达：采用Western-Blot方法检测大鼠晶状体中VEGF、活性Src(p-Src418)及总Src（c-Src)蛋白表达水平。在细胞水平上观察补青颗粒对大鼠晶状体上皮细胞（LEC）SFK-VEGF通路的影响。应用紫外线照射方法诱导大鼠晶状体上皮细胞（LEC）氧化应激损伤。给予含药血清及空白血清干预，观察补青颗粒（BQ）对LEC SFK-VEGF通路的影响。观察指标：蛋白表达、蛋白定位、细胞周期分析、细胞迁移分析、细胞骨架蛋白（F-actin：）分布。结果：QJW及BQP含药血清均可显著抑制SRA01/04细胞的增殖活性（P<0.05），而HG+MBG组的抑制效果优于HG+QJW组（P<0.05，P<0.01）；FCM结果：QJW及BQP含药血清组均为细胞G0/G1期比例均增加（P<0.05），S期比例减少（P<0.05），而HG+MBG组最为显著（P<0.01）；免疫荧光结果：Atg7蛋白在HG+HBG组表达增加最为显著，LC3a蛋白和Beclin1蛋白在HG+MBG组上调最为显著。WB法检测：SFK、VEGF、ZO-1、N-cadherin结果均具有显著性差异（（P<0.05或P<0.01））。结论：补青颗粒对白内障大鼠晶状体氧化应激损伤的具有保护作用，并且有可能通过SFK-VEGF通路发挥其治疗作用。