MicroRNA-122在砷诱导鸡肝细胞自噬中的作用机制

Arsenic is the most seriously dangerous environmental pollutant. Liver is an important target organ in chicken with arseniasis. In our previous research, we found that arseniasis could induce autophagy in the hepatocyte of chicken. However, the mechanism is still unclear. The present study researches on the mechanism of encoding genes in regulation of autophagy, and discusses the role of noncoding genes microRNA-122 cell autophagy in liver of chicken with arseniasis. MicroRNA-122 is widely existed in the liver and involved in the pathophysiologic process of liver. Using microarray, real-time quantitative PCR, western blot, transmission electron microscope and omics technologies to detect the transcriptome, proteomics in the liver, the expressions of microRNA-122 and autophagy-related genes, forecast the potential microRNA-122target genes using the online software, screen the possible signal pathway in the hepatocyte autophagy of chicken induced by arsenic. Make restrained and over-expressed microRNA-122 and its target gene models in the hepatocyte of chicken in vitro, using real-time quantitative PCR, western blot, and flow cytometry technologies to detect autophagy in the liver cell, expressions of the target gene etc. The aim of the present study is to illustrate the possible mechanism of microRNA-122 on the pathway of the chicken liver cell autophagy induced by arsenic, lay a theoretical foundation for chicken liver damage induced by arsenic, and provide a use for reference in comparative medicine.

砷是危害最严重的环境污染物，其毒害作用的主要靶器官是肝脏。本项目组前期研究发现砷能够引发鸡肝细胞自噬，但其机制尚不明确。非编码基因microRNA-122专一表达于肝脏，参与肝细胞应急应答机制，本研究以其为切入点探讨砷诱导鸡肝细胞自噬的作用机制。应用实时定量PCR、免疫印迹、透射电镜和组学技术等检测染砷肝脏转录组、蛋白组、microRNA-122及自噬相关基因的表达，并利用microRNA靶标预测软件预测microRNA-122的靶基因及其在砷诱导的鸡肝细胞发生自噬过程中的可能信号转导通路。利用体外鸡肝细胞培养，建立microRNA-122抑制与过表达模型、及其靶基因抑制或过表达模型，应用实时定量PCR、免疫印迹及流式细胞术等方法，检测肝细胞自噬及靶基因表达等，阐明microRNA-122在砷诱导的鸡肝细胞自噬过程中的信号转导通路，为防治砷诱导的肝损伤提供理论依据，亦可为比较医学提供借鉴。

肝脏是禽类最大的解毒器官，也是研究砷中毒的靶器官之一。前期研究发现，砷中毒可致鸡肝脏细胞发生自噬，但其机制尚不明确。有研究报道miRNAs能够通过调控下游信号通路参与NaAsO2引起的自噬过程。miR-122是肝脏的特异性miRNA，约占肝脏总miRNA的72%，参与调控肝脏的生长、发育以及相关疾病的发生、发展。本研究通过复制砷中毒肉鸡模型，应用病理学观察和抗氧化水平检测，确定了砷的肝毒性；应用超微结构观察、q-PCR技术、Western Blot等技术，检测了砷中毒肝脏中自噬体形成以及自噬相关基因mRNA和蛋白水平。构建原代鸡肝细胞miR-122过表达和敲低模型研究miR-122在亚砷酸钠致肝细胞毒性中发挥的生物学功能；在肝细胞中识别并验证miR-122的靶基因PKM2及其在亚砷酸钠致肝细胞毒性中发挥的调控作用。结果表明：.1. 使用含NaAsO2（30 mg/kg）日粮饲喂雏肉鸡90 d后，发现肉鸡肝脏组织受损（HE），肝细胞显示明显坏死和凋亡（透射电镜），以及氧化应激（生化实验）等病理变化。在实验组肝脏组织中观察到了自噬现象，q-PCR和Western Blot检测结果亦显示，该组自噬相关基因比对照组有显著上调。.2. 培养鸡原代肝细胞，在不同NaAsO2作用浓度/时间下，以MTT实验、肝功生化指标（ALT、AST）确定NaAsO2作用的最佳条件；以抗氧化指标（生化实验）、自噬相关蛋白表达水平（q-PCR+Western Blot）评估氧化应激性自噬模型建立与否。.3. 在建立鸡原代肝细胞自噬模型的基础上，成功构建了miR-122过表达和敲低模型。利用生物信息学预测软件TargetScan和MiRDB预测了miR-122靶基因，通过构建双荧光素酶报告基因验证了PKM2是miR-122的靶基因。通过q-PCR和Western Blot方法，在模型1和2的实验组中均检测到miR-122水平的上升和PKM2水平的下降。.4. miR-122过表达提高砷中毒细胞模型中的自噬水平，miR-122敲低则表现出相反的结果，而这种结果被si-PKM2通过PI3K/AKT/mTOR自噬抑制通路所回复。.综上所述，NaAsO2诱导miR-122的高表达可以通过PKM2的负调控提高肝细胞对NaAsO2的敏感性，促进氧化应激细胞的自噬。本研究为探索砷中毒的微RNA调控机制奠定了基础。