双光子荧光显微镜对活体植物细胞融合（Cytomixis）现象的三维重建及机理研究

高等植物细胞间的细胞融合（Cytomixis）是一种重要的细胞生物学现象，在植物的变异和物种进化方面具有重要的意义。但长期以来，国际上对细胞融合的研究，在起因问题上争论不休，其他方面也没有很大进展。本项目利用激光共聚焦显微镜和双光子荧光扫描显微镜能够对活体植物组织细胞较深水平上进行三维动态成像的特点和优势，结合新型的双光子荧光探针和分子生物学的技术，得到模式植物拟南芥及烟草的荧光蛋白转基因植株，并其在活体条件下的细胞融合现象进行三维重建，同时对活体条件下的细胞融合的发生、调控机理进行研究，从而从根本上解决细胞融合现象研究中人工假象与固有现象的争论，确定该现象是否为细胞正常的生理活动，并初步阐明细胞融合的机理。以解决国际上长期争论未决的问题。

染色质穿壁现象于本世纪初在植物体细胞中发现。是指染色质从一个细胞转移到另一个相邻细胞中的现象，命名为cytomixis，也称细胞融合。其本意为”染色质穿壁运动”或”细胞核穿壁运动”。细胞融合普遍存在于被子植物中。在植物体内,细胞融合现象广泛存在于绒毡层，子房壁，花药壁，珠被，珠芯，胚乳，原胚表皮，花梗，苞片，根茎尖等营养组织间，主要见于花粉母细胞的凝线期。但在减数分裂的整个过程中，甚至在四分体中都有存在。.细胞融合发现之初即存在着人工假象与固有现象的争论。认为细胞融合是正常生理现象的人当中，又存在着细胞融合是由基因直接控制的过程与并非由基因直接控制的过程之争。细胞融合虽然在不计其数的植物中发现，但究其原因众说纷纭，至今尚不清楚。.近十年来，由于生物荧光成像技术和荧光蛋白技术的飞速发展，生物活体组织和细胞的三维成像在生命科学研究中具有重要的意义。目前，利用双光子激光扫描显微镜和双光子荧光探针，能使不透明的、较厚的活体组织在较深的层面上进行清晰荧光成像。然而，由于目前缺乏双光子吸收截面大，特异性高的双光子生物探针，因此限制了双光子激光扫描显微镜的生命科学领域的广泛应用。.我们通过分子设计、理论预测、得到两个有机阳离子双光子DNA探针BMVEC9E-BHVC。利用该荧光探针对活体组织和细胞中双光子荧光成像的机制和性能进行系统的研究，结果显示：在活体组织和细胞中，与传统的单光子荧光探针相比较，它们具有更好的双光子荧光特性，同时对活体植物不透明组织（花药组织）中成像质量和深度有显著地提高。.我们进一步利用该荧光探针和双光子显微镜，对活体植物细胞细胞融合现象进行三维动态成像研究，从而从根本上解决了细胞融合现象研究中人工假象与固有现象的争论。同时，对各种转基因的植株（包括对细胞内微管微丝及各种离子的荧光蛋白的标记）细胞融合中的发生部位、动力问题、离子影响以及基因调控等机理问题进行系统的研究，从而确定该现象为细胞正常的生理活动。并受一系列复杂过程的调控，初步阐明细胞融合的机理。