多粘菌素耐药基因mcr-1在猪体肠道内菌群中的分布特征及跨种属传播的分子机制

Since its discovery at the end of 2015, the polymyxin resistance gene mcr-1 had attracted much attention from researchers and governments all over the world. The aim of this study is to study the polymyxin resistance gene mcr-1. The bacteria were separated and identified from pig manure collected. Using the method of S1-PFGE and Southern blot, plasmid distribution in bacteria and location of mcr-1 gene were analyzed. Using plasmid conjugation test and electrotransformation, the transmission of mcr-1 gene was analyzed. And the role of ISApl1 in the resistance of mcr-1 gene was discussed. The results will indicate the distribution and transmission mechanism of mcr-1 gene in bacteria of different species from the same body. These data will provide the theroretical basis for controlling effectively the spread and diffusion of polymyxin resistance gene mcr-1.

多粘菌素耐药基因mcr-1自2015年底发现以来，已受到世界各国科研人员和政府的热切关注。本研究拟以多粘菌素耐药基因mcr-1为研究对象，通过采集猪的粪便样品，分离细菌并鉴定，采用脉冲场凝胶电泳（S1-PFGE）和Southern blot杂交分析细菌携带质粒情况及mcr-1基因的定位；采用质粒接合试验和电转化试验分析mcr-1耐药基因的传播特性，以及对插入序列ISApl1在mcr-1基因耐药中的作用进行分析；研究结果将阐明mcr-1耐药基因在同一机体内不同细菌间的分布特征及跨种属传播的分子机制，为更有效的控制多粘菌素耐药基因mcr-1的传播和扩散提供理论依据。

根据RAA技术原则，建立检测多黏菌素耐药基因mcr-1的RAA检测方法；应用PCR方法筛选、分离和鉴定mcr-1基因阳性细菌；采用药敏试验和PCR方法分析分离菌株的耐药性及其耐药表型；并使用MLST和PFGE方法鉴定mcr-1基因阳性大肠杆菌的ST类型和对这些大肠杆菌进行聚类分析，探明细菌的分布特征和亲缘关系。结果显示，该建立的RAA方法能特异性地检测多黏菌素耐药基因mcr-1和最低能检测出100的mcr-1阳性质粒拷贝数，检测时间在21 min之内；从福建省7个地市的41个猪场614份粪便中共分离获得112株mcr-1基因阳性细菌，其中大肠杆菌为93株。随机挑选43株mcr-1基因阳性细菌的耐药性显示这些分离菌株均具有多重耐药性。耐药基因检测结果也显示这些分离菌株均具有明显的多态性特征。其中39株mcr-1基因阳性大肠杆菌共分为19个ST型和4个新的未知ST型，其中ST10类型最多，共有9株菌株。PFGE图谱显示，39株mcr-1基因阳性细菌共获得30种PFGE谱型，具有高度多样性，ST10中的6株细菌表现出同一克隆关系。结果表明，该研究建立了一种快速、特异性好、敏感性强的能检测多黏菌素耐药基因mcr-1的诊断方法；mcr-1基因阳性细菌主要为大肠杆菌，少部分为肠杆菌科其他菌株，且这些菌株具有明显的多重耐药性。mcr-1基因阳性大肠杆菌在地域分布上也具有多态性和多样性特点。多粘菌素耐药基因mcr-1主要是通过质粒的水平转移进行传播，也可以通过插入序列的转座完成转移进行传播。且质粒类型是以IncI2为主，IncX4为次。插入序列ISApl1在mcr-1基因的传播过程中，不是一种必要因素。这些结果为抗生素的应用提供了科学依据，并为多粘菌素耐药菌的控制奠定了研究基础。