壮药龙钻通痹方对RA大鼠成骨细胞分化的Runx2调控环路机制研究

In our previous studies funded by the National Science Foundation, our team investigated the mechanism underlying the intervention of the interaction between HMGB1-TLR4 and RANKL-NF-κB signaling pathways in rheumatoid arthritis (RA) by Zhuang medicine Longzuantongbi Formula, and found that that formula was somewhat effective in regulating the Runx2 transcription factor. Runx2 plays an important role in the pathogenesis of RA. It is not only the target of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, but the target of the bone morphogenetic proteins (BMPs/Smads) signals. In order to further explore the mechanism of the effect of the formula on the Runx2 pathway, this project studies key factors of the Runx2 and MAPK pathways (TGF-β1, RaS, Raf, MEK1/2, ERK1/2) and those of the BMP2/Smads pathway (BMP2, Smad1, Smad5, Smad8, Osterix) and their interaction by conducting in vitro experiments of RA rats and osteoblasts using RT-PCR, Western Blotting, transmission electron microscope and other testing methods, to explore the mechanism of Runx2 regulating the MAPK and BMP2/Smad signal transduction pathways and the relatedness between these two pathways.

前期国家自然基金，课题组研究了壮药龙钻通痹方对RA 的HMGB1-TLR4/ RANKL-NF-κB信号交互作用的干预机制，并进一步发现该方对Runx2转录因子有一定的调控作用。在类风湿性关节炎的病机中Runx2转录因子在其中发挥重要作用，其不仅是MAPK通路的靶目标，亦是BMPs/Smads信号的靶目标，为了探索该方在Runx2路径的作用机制，本课题将通过RA大鼠与成骨细胞的体内外实验，采用RT-PCR、Western Blotting、透射电镜等检测方式，开展Runx2、MAPK通路关键因子（TGF-β1、RaS、Raf、MEK1/2、ERK1/2）、BMP2/Smads通路关键因子（BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Osterix）及其交叉路径的研究，从而探讨Runx2对MAPK、BMP2/Smad信号转导通路的调控机制。

类风湿关节炎（RA）属于壮医“发旺”(壮名：Fungcaep)范畴。“发旺”的发生多由于感受邪毒、正气虚弱、情志失调等引起。风、寒、湿、热等毒邪乘虚侵入人体后，毒邪阻滞于“龙路”、“火路”干线及网络，使气血运行不畅，筋骨肌肉关节失养，不通则痛、不荣则麻，形成“网络阻滞致痹，则出现筋骨肌肉关节疼痛或感觉异常而成“发旺”。.本课题将通过RA大鼠与成骨细胞的体内外实验，采用RT-PCR、Western Blotting等检测方式，开展Runx2、MAPK通路关键因子（RaS、Raf、MEK1/2、ERK1/2）、BMP2/Smads通路关键因子（BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Osterix）及其交叉路径的研究，从而探讨Runx2对MAPK、BMP2/Smad信号转导通路的调控机制，结果提示壮药龙钻通痹方干预RA大鼠可能从第7d开始显效，效应峰值可能出现在21d附近。壮药龙钻通痹方促进RA大鼠成骨细胞分化的机制可能与激活BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、Osterix、Runx2通路有关。.壮药龙钻通痹颗粒可能通过下调类风湿关节炎模型大鼠各关节组织中Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2的基因以及蛋白表达水平，减轻滑膜病变，延缓软骨和骨破坏过程，达到对类风湿关节炎的治疗作用。.龙钻通痹方含药血清可以有效促进BMP2-Smads信号通路中关键因子BMP2、Smad1、Smad4、Smad5、Smad9、RUNX2等mRNA和蛋白的表达,结果说明龙钻通痹方可能是通过RUNX2、MAPK、BMP2/Smads信号通路促进成骨细胞的增殖。促进成骨细胞的增殖，从而改善骨侵蚀可能是龙钻通痹方治疗类风湿关节炎的作用机制之一。.综合上述研究结果，提示说明龙钻通痹方可能是通过RUNX2、MAPK、BMP2/Smads信号通路，并通过Runx2-MAPK-BMP2/Smad-Runx2调控环路来发挥作用，体现对类风湿性关节炎成骨细胞分化的胞内信号转导作用机制。.通过本研究基本可以验证了明确壮药龙钻通痹方骨保护的效应累积变化规律，及其干预Runx2-MAPK-BMP2/Smad-Runx2调控环路的作用机制，揭示龙钻通痹方的最佳治疗时机，从该信号路径角度作证了本项目申请书中提出的壮医“网络阻滞致痹”理论科学内涵。