针对脑缺血多环节损伤的融合蛋白分子设计、制备及活性研究

Ischemic stroke severely threatens human health, and the therapeutic effect of clinical drugs is far from satisfactory. Most of neuroprotective agents in preclinical study have failed to pass clinical trials in the past decades. One of causes is that these neuroprotective agents aimed to single target cannot block all perplexing pathophysiogical mechanisms. An omnibearing protective strategy amid to neurovascular unit have been recently raised and been approved.. Novel neuroprotective agents acting on multiple targets maybe overcome the shortcomings of those agents aimed to single target and bring the dawn for the treatment of ischemic stroke. A peptide with EphA2 antagonistic (BBB protection ) and anti-apoptotic effects (BYLRY-1) has been obtained in our primary study, it shows better protective effect in tMCAO mice model than that of the peptide with EphA2 antagonistic effect alone. This project will work on the basis of BYLRY-1 data. 1) Further design peptides with anti-oxidation, anti-inflammation, anti-apoptosis and BBB protection ; 2) clone, express and purify and identify these peptide; 3) evaluate their neuroprotectve effect in vitro and in vivo; 4) reveal their mechanism. The aim of this study is to confirm the superiority of these designing philosophy and harvest novel active peptides/proteins with intellectual property rights

脑卒中严重危害人类健康, 目前临床上药物治疗效果不佳。近些年大量临床前有效的神经保护剂在临床试验中以失败告终。原因之一是针对单靶点设计的神经保护剂不能阻断脑缺血时复杂的病生理反应。新近提出的全方位保护神经血管单元的策略受到普遍认可。针对缺血时脑内复杂的损伤机制设计和研发作用于多环节、多靶点的新型神经保护剂，可克服单一靶点神经保护剂的缺点，为临床带来曙光。课题组前期工作已获具有针对抗凋亡和保护血脑屏障的双功能融合蛋白BYLRY-1，在小鼠脑缺血模型上发现其比单一血脑屏障保护肽具有更好的效果。本研究拟在在BYLRY-1基础上，1) 利用计算机辅助蛋白设计技术，设计和制备具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和保护血脑屏障四功能融合蛋白、并连接穿膜肽。2）在体内、外模型上研究融合蛋白对神经血管单元的保护作用；3）揭示该融合蛋白的作用机制。旨在证实这种设计思想的可能优势，并获得强效的、有自主知识产权的新型蛋白。

缺血性脑卒中严重危害人类健康, 现临床上仅用溶栓药效果不佳，神经保护剂可能改善溶栓药的疗效，但近十几年大量临床前有效的神经保护剂在临床试验均告失败。原因之一是针对单靶点设计的神经保护剂不能阻断脑缺血时复杂的病生理反应。针对脑缺血时复杂的损伤机制设计和研发作用于多环节、多靶点的新型神经保护剂，有望为临床带来新的希望。.本课题重组、表达纯化了单一的抗炎（IL-10，I）、抗凋亡（BcL-xL，B）、抑制血脑屏障破坏的蛋白（E2，E），在此基础上设计、重组、表达纯化了双功能或三功能的融合蛋白B-I-E、B-I、B-E和I-E，用tMCAO模型初步评价了它们的神经保护作用。结果发现：B-I-E、B-I、B-E、I-E及I可以明显减小脑梗死体积，同等剂量下，B与E无明显作用；与B相比，B-I-E与B-E减小梗死体积的作用更强；与E相比，B-I-E与B-E减小梗死体积的作亦更强。提示多功能比单功能的蛋白具有更好的神经保护作用。为了确证以上结果，对部分蛋白进一步纯化，证明B-I可以在其N端的TAT肽段的引导下跨过血脑屏障。在低剂量时（0.1 μmol/kg），B或I未显示明显作用，而B-I可以明显减小脑梗死体积。在高剂量时（0.2 μmol/kg），各给药组均可减小梗死体积，而B-I的作用明显强于B或I。证明双功能蛋白与单功能蛋白相比具有更强神经保护作用。B-I与B处理均明显减少脑组织凋亡细胞百分率; B-I与B显著降低小鼠脑皮层caspase-3活性。B-I与I处理可明显降低脑皮层TNF-α含量，B-I的作用较强。这些结果表明：融合蛋白B-I确有抗炎和抗凋亡双重作用，其作用优于单功能蛋白。.本研究结果的意义在于证明了针对脑缺血神经保护剂的研究不应局限于某一个受体、酶离子通道或信号途径等，而应该从脑缺血神经损伤级联反应的多环节考虑，研究可作用于多环节多靶点的药物，才可能获得理想神经保护的临床疗效。