氧化损伤蛋白导致足细胞凋亡的受体途径研究

足细胞损伤和缺失是慢性肾小球疾病发生、发展的关键因素，但导致足细胞丢失的原因和分子基础目前尚未完全阐明。申请者的前期研究结果发现，糖尿病、代谢综合征和慢性肾脏病时体内蓄积的氧化损伤蛋白能通过Redox依赖的途径诱导足细胞凋亡，并导致肾小球足细胞的数量和密度减少，但氧化损伤蛋白与足细胞相互作用的受体途径目前尚不清楚。本项目拟通过细胞免疫共定位技术、抗体封闭以及基因敲除技术进一步研究氧化损伤蛋白与足细胞相互作用的特异性受体途径；并明确氧化损伤蛋白作用对足细胞表面氧化应激相关受体表达的影响。从而阐明氧化损伤蛋白诱导足细胞凋亡并导致足细胞脱失的上游分子机制，为理解肾小球疾病足细胞损伤的发病机制提供新信息，并为其干预提供新靶点。

RAGE受体即晚期糖基化产物（AGE）的受体，是一类免疫球蛋白超家族受体，在糖尿病肾病、炎症、缺氧、缺血-再灌注模型中表达明显上调，参与了疾病的发生发展。在肾小球中，RAGE受体主要表达在足细胞表面，参与多种蛋白的吞噬并诱导多种病理反应的发生。. 本研究深入探讨了AOPPs诱导足细胞凋亡的相关受体途径和分子信号机制；观察氧化损伤蛋白（AOPPs）与在体目标受体表达，以及对于足细胞氧化损伤和凋亡途径的影响；并且观察受体被干扰的细胞模型上，检测氧化损伤蛋白对足细胞活性氧及其相关信号途径的影响。实验结果表明，AOPPs显著诱导肾脏RAGE受体表达，并且定位于肾小球足细胞；AOPPs呈剂量和时间依赖性的方式显著诱导体外培养的足细胞RAGE受体的表达，提示了RAGE受体在AOPPs诱导肾脏损伤发生机制中占有重要地位。采用免疫共沉淀和双色免疫荧光方法，发现足细胞RAGE受体与AOPPs相结合及共定位于细胞膜，进一步证实了足细胞RAGE受体在AOPPs诱导的足细胞反应中的关键地位。采用受体被干扰的体内外模型中，检测对于AOPPs诱导足细胞凋亡的影响。实验结果发现RAGE中和抗体能够明显抑制AOPPs诱导的足细胞凋亡，以及凋亡蛋白p53、Bax、caspase 3、PARP-1的表达。体内实验中同时采用小鼠RAGE单克隆中和抗体（B2-2）处理AOPPs负荷的C57小鼠，收集血尿及肾脏标本，检测RAGE受体干扰对于AOPPs诱导的足细胞凋亡的影响。研究表明RAGE中和抗体能够显著抑制慢性AOPPs负荷的C57小鼠足细胞凋亡及凋亡蛋白p53、Bax、caspase 3、PARP-1的表达，从而证明RAGE抗体在AOPPs诱导的足细胞凋亡中占有关键地位。深入的机制学研究表明，AOPPs通过与RAGE受体相结合，激活了PKCα蛋白，使其磷酸化活化，从而诱导了NADPH氧化酶的激活，所生成的活性氧作为信号分子启动了足细胞凋亡。该研究成果发表在国际肾脏病学界排名第二的期刊Kidney International（IF7.916）上，期刊配发述评，称此研究“为阻断氧化应激造成的肾细胞凋亡、防止肾功能减退提供了新治疗靶标”。本研究首次证实在糖尿病、代谢综合征和慢性肾脏病时体内蓄积的AOPPs能够与RAGE受体相结合，诱导足细胞的凋亡、氧化应激等相关信号途径。