ZmCCaMK与ZmBSK1相互作用在BR诱导抗氧化防护中的功能分析

Our previous study showed that ZmCCaMK plays important roles in BR-induced antioxidant defense and crop drought tolerance. Further, an interacting protein of ZmCCaMK---ZmBSK1 was screened. In this project, based on our previous studies for this project, we intend to identify the interaction between ZmCCaMK and ZmBSK1, and to clarify the phosphorylation sites of substrate. Further, we want to elucidate the role of ZmCCaMK interacting with ZmBSK1 in BR-induced antioxidant defense, BR-induced H2O2 production and drought tolerance by using ZmCCaMK and ZmBSK1 overexpressing or silencing, direct mutation of substrate phosphorylation sites overexpressing transgenic maize, with transient overexpressing or silencing test in maize protoplasts. Finally, we shall clarify the roles of ZmCCaMK interacting with ZmBSK1 in BR-induced antioxidant defense and drought tolerance, and further clear the mechanisms of CCaMK in plants under stresses. This project is not only helpful to our understanding the mechanisms of BR-induced antioxidant defense signal transduction, but also has an important significance for improvement of crop stress tolerance by using molecular biology manipulation.

我们前期工作表明，ZmCCaMK在BR诱导的抗氧化防护及增强作物耐旱性中起重要作用，进一步筛选到可能与ZmCCaMK存在直接相互作用的蛋白质---ZmBSK1。本项目拟在前期工作的基础上，进一步验证ZmCCaMK与ZmBSK1之间的相互作用，鉴定ZmCCaMK与ZmBSK1底物磷酸化位点；利用ZmCCaMK、ZmBSK1过表达与基因沉默、底物磷酸化位点突变的转基因材料结合瞬时体系，明确ZmCCaMK与ZmBSK1相互作用在BR诱导的抗氧化防护中的作用及其信号转导机制、与BR诱导的H2O2的关系及在玉米耐旱性中的作用。最终阐明ZmCCaMK与ZmBSK1相互作用在BR诱导抗氧化防护进而增强作物耐旱性中的作用，进一步明确CCaMK参与植物抗逆反应的作用机制。这一研究的开展不仅有利于人们理解逆境下BR诱导抗氧化防护信号转导机理，而且也对于人们利用分子生物学手段提高作物的耐逆性具有重要的指导意义。

植物激素油菜素内酯（Brassinosteroids, BRs）参与调节植物的生长发育，并且能够减轻干旱等多种非生物胁迫对植物造成的影响。实验室前期研究表明，钙/钙调素依赖性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinase, CCaMK）参与BR诱导的抗氧化防护过程，并增强植株对干旱胁迫的耐受性。然而，CCaMK在这一过程中作用的具体机制还不清楚。我们鉴定到了一个与ZmCCaMK相互作用的蛋白质---ZmBSK1（Zea mays BR-signaling kinase 1 ）。玉米ZmBSK1参与BR诱导的抗氧化防护过程并增强玉米植株对干旱胁迫的耐受性。同时，我们发现ZmBSK1可以体内外磷酸化ZmCCaMK的第67位丝氨酸（Ser67）。BR诱导的Ser67位点磷酸化和ZmCCaMK活性的增加是依赖于ZmBSK1的。进一步研究显示，Ser67位点的磷酸化增强了ZmCCaMK与Ca2+及Ca2+/CaM的结合能力，促进了ZmCCaMK的自磷酸化和底物磷酸化活性，最终正调控了BR诱导的抗氧化防护及增强了玉米干旱胁迫的耐受性。此外本项目还发现ZmCCaMK的自磷酸化位点Thr420和Ser454在BR诱导的抗氧化防护及玉米耐旱性中也发挥重要作用。ZmNAGK、ZmNAC49、XTH30等基因在植物对干旱和盐等胁迫的响应中发挥积极作用。本研究的开展有助于人们对植物细胞CCaMK参与植物抗逆反应作用机制的认识，拓展了人们对逆境下BR诱导植物细胞抗氧化防护信号转导机理的理解，有利于揭示作物复杂的耐旱机理，对于人们利用分子生物学手段提高作物的耐逆性具有重要的指导意义。