FGF9基因在关节形成及发育中的作用

Recently the role that FGFs family plays in the development of bone and joint morphogenesis is attracting more and more attentions. Our previous investigations show that FGF9 mutation could cause weakening of binding with its receptor FGFR3, then decrease in FGF signal activation. This may be the main cause of the genetic disease of multiple synostoses syndrome, which is characterized by retarded joints development with joint fusion in elbows, knees or other parts of the body. Experiments with FGF9 mutated mice show that weakening FGF signals can seriously affect the development and formation of various parts of the joint, and enhance the bone calcification. These results suggest that dysfunction of FGF9 may cause imbalance between FGF9 monomer and Dimer, giving rise to ectopic expression, thus creating gain of function features for the dominant effect. In this study, we will investigate the effect of the FGF9 mutation on the joint development, from appearance of limb bud through the formation of the joint. Gene mutation effects on the development of chondrocytes and osteoblasts cells in growth plates will be explored, shedding light on the important role of FGF signaling on joint development in proteins or RNA level. The study is expected to expand the application of FGF family in the treatment of bone and joint diseases.

FGF家族在骨骼及关节发育中的作用越来越受到关注。课题组在前期工作中，发现FGF9基因突变能够导致与受体FGFR3结合减弱使FGF信号激活下降, 从而引起多发性骨性关节连接综合征的发生，这一疾病是以多处关节形成及发育发生障碍为特征的遗传性疾病。在FGF9基因突变小鼠模型上发现，FGF信号的减弱可以严重影响各部位的关节发育和形成，并使骨骼钙化增强。已有的研究结果提示，FGF9的失功能性突变可能打破了其单体与同二聚体间的平衡，发生弥散性异位表达，进而造成功能获得性的显性效应。课题组将利用该模型，从关节发育早期到关节形成后的骨骼发育，检测突变对肢芽的形成以及软骨细胞、成骨细胞发育的影响，从蛋白水平、RNA水平阐明FGF信号对关节发育的重要作用，以此揭示FGF信号影响关节发育的机制。这项研究有望拓展FGF家族在骨关节疾病治疗中的应用，从而带来一个新的治疗前景。

多发性骨性关节连接综合征(multiple synostoses syndrome, SYNS)是一类常染色体显性遗传疾病，课题组在一SYNS3型家系中发现一新的致病基因-成纤维生长因子9（FGF9），并报道了这一基因第99 位的丝氨酸被天冬酰胺所替代。这一突变导致FGF9信号传导障碍、软骨细胞增殖及分化异常，致使关节发生骨性连接。为研究FGF9基因在骨关节发育中的作用及其突变导致SYNS3 的机制，本课题将FGF9 单碱基突变（S99N）定点敲入小鼠基因组，在整体动物水平上研究该基因突变对关节发育的影响。FGF9（S99N）突变小鼠显示出与人类SYNS3相似的表型，包括尾部椎骨和肢体关节部分或完全融合。进一步研究表明，在关节发育早期，FGF9（S99N）突变影响了间充质干细胞向软骨的分化，进而影响了关节区的形成。与此相一致的是，肢芽组织培养实验表明，FGF9抑制了Sox6和Sox9表达。同时上调关节发育重要控制基因Gdf5，调控Interzone的形成。但突变FGF9的这些作用减弱。造成突变小鼠在关节发育早期中间层间质细胞向软骨细胞发生过度分化，从而导致关节融合。进一步研究发现，FGF9能够通过激活GDF5的启动子区调控GDF5在肘关节和膝关节形成区的表达。并且突变FGF9减弱了关节区的FGF信号。利用体外亲和力实验和计算机蛋白模拟，揭示了突变改变了FGF9 蛋白的空间构象，与受体结合的氨基酸位点与中间分子肝素的结合位点发生冲突，导致肝素和FGFR竞争性地与FGF9蛋白结合，同时增强与肝素的亲和力，共同造成 FGF9 蛋白与受体结合减弱，干扰了FGF9/FGFR/heparin之间的相互作用，最终导致发育关节中FGF9信号转导下降。这项研究进一步揭示了FGF9在胚胎关节发育中的重要作用。. 此外，Fgf9基因在骨代谢中发挥重要作用。突变小鼠骨密度增加，骨骼中成骨细胞数量增加，功能增强，同时破骨细胞数量减少。体外诱导分化实验证实 S99N 突变显著提高骨髓间质细胞向成骨细胞分化和矿化能力，抑制单核细胞向破骨细胞诱导分化和成熟。同时在体外成骨细胞系中发现Fgf9能够通过 MAPK 和PI3K/AKT信号通路下调成骨相关基因表达，抑制成骨作用。