利用CRISPR/Cpf1技术在基因调控水平上研究BR途径参与水稻与白叶枯病原菌互作的机制

BR is an important phytohormone which plays a role in plant growth, development and responses to biotic and abiotic stresses. A number of studies suggested BAK1 and BZR1 mediate the crosstalk between BR and PTI signaling pathways in Arabidopsis, and BR application enhances the resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice, anyhow the underlying mechanism is still a puzzle. In this proposal, we will target all the potential cis-regulatory elements in the upstream, downstream regions and the introns of OsDWF4, OsSERK2 and OsBZR1, key genes involved in BR biosynthesis, metabolism and signaling pathway in rice, using a CRISPR/Cpf1 endonuclease-mediated genome editing method we developed, and generate three mutant libraries to isolate the new germplasms with novel traits. Genome-wide transcriptional analysis will be further carried out in several different mutant lines challenged with Xanthomonas oryzae pv. oryzae to uncover the potential regulation of BR pathway related to defense response in rice. These studies will greatly promote the development of molecular crop breeding in terms of cis-regulatory element editing and gain more insights into BR-regulated defense response in rice.

BR是一种重要的植物激素，广泛参与植物的生长发育、抗病和抗逆反应。在拟南芥中，BR通路与PTI途径在一定程度上有相互作用，但其具体机制还有待于进一步研究。基于外源施用BR增强水稻的抗病性以及BR通路存在着一系列的反馈调控，本项目以水稻BR合成代谢途径关键基因OsDWF4、BR受体复合物关键编码基因OsSERK2以及BR下游信号转导途径关键转录因子OsBZR1为切入点，利用我们最新开发的CRISPR/Cpf1系统介导的高效基因编辑技术，对3个靶基因的启动子、内含子和终止子序列进行饱和DNA小片段删除突变体库创制，通过破坏其中所有潜在的DNA调控序列试图改变BR控制的性状。进一步以水稻新株型为筛选标记，借助转录组学分析，阐述BR途径参与水稻与白叶枯病原菌互作的基因调控相关机理。上述工作的开展，将大大推动基因调控元件编辑改良的作物分子育种方向发展，以及促进我们对BR调控水稻抗病性的进一步了解。

BR通路涉及的转录调控程序非常复杂，所控制的抗病过程与生长发育之间的存在着精细的平衡。2018年立项的该课题旨在通过Cas系统介导的高效基因编辑技术，对OsBZR1等靶基因的启动子、内含子和终止子序列进创制饱和DNA小片段删除突变体库，挖掘其潜在的改变BR控制的性状的调控元件，阐述BR途径参与水稻与白叶枯病原菌互作的基因调控相关机理。通过4年的研究，我们主要进行了以下研究。第一，借助不同来源的Cas蛋白成员/变体建立了一系列的水稻基因组编辑系统，明确了各编辑体系在编辑效率，识别PAM等方面的特点，为保证项目顺利完成提供了更多更有效的技术支撑。第二、利用除草剂靶标基因易筛选的特性，利用开发的基因组编辑工具创新性的建立了人工进化技术，在水稻细胞内人工模拟自然基因的变异和进化过程，筛选具有除草剂双草醚抗性的新种质和鉴定4个关键遗传变异位点，验证了饱和突变技术定向进化内源基因的可行性。第三、项目组选择了OsBZR1等作为靶标基因，实现了OsBZR1等基因启动子调控区域的有效饱和突变，创制了饱和DNA小片段删除突变体库，通过突变位点分析，遗传分析，表型鉴定等，筛选获得水稻新株型或者抗病新种质。第四、利用高活性的腺苷脱氨酶优化建立了高效的腺嘌呤碱基编辑工具，并利用基因组和转录组测序分析了其脱靶效应。项目的实施，将大大推动基因调控元件编辑改良的作物分子育种方向发展。