斜纹夜蛾核多角体病毒诱导甜菜夜蛾细胞早期凋亡的关键基因筛选及功能研究

The insect cell apoptosis induced by baculovirus infection limit the host range and wide application as bio-pesticide of baculovirus. In addition, most diseases relate to cell apoptosis, such as AIDS、cancer, et al, furthermore, the pathway of insect cell is similar to other animal cell. So, it must be very important in the study of buculovirus inducing insect cell apoptosis in order to the development of baculovirus bio-pesticide. .In present study, the results demonstrated that Spodoptera exigua (Se) 301 cells infected by Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus (SpltMNPV) had obvious pathologic phenomenon that was deduced as early apoptosis and had not processed to the late phase namely apoptosis bodies. It was a good model of SpltMNPV-infected Se301 cells in the project. By using the customized microarray and bioinformatics, those SpltMNPV genes with significant alteration in the transcription were selected during Se301 cells early apoptosis. The function of these key genes were analyzed by applying RNA interference. .It will be discovered the molecular theory of the baculovirus inducing the insect cell early apoptosis in transcriptome and found the limit factors of host range in the project. These results will be the theory basis of scientific utilization and hereditarily change of baculovirus.

杆状病毒因能代替传统化学农药被视为安全的生物杀虫剂，但严格的宿主范围限制其广泛应用，最近研究表明细胞凋亡是限制杆状病毒宿主范围的重要因素。此外，许多疾病与细胞凋亡密切相关，如AIDS、癌症等，而且动物细胞中的凋亡调节通路是相似的。因此，杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡机理的研究对杆状病毒杀虫剂的开发有重要作用，对疾病研究也有一定的价值。.近期本项目申请人研究发现，斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltMNPV）能诱导甜菜夜蛾离体培养细胞（Se301）发生早期凋亡，其凋亡症状与典型的凋亡有明显不同，本申请项目拟以其作为研究模型，利用基因芯片技术，结合生物信息学分析，筛选SpltMNPV诱导Se301细胞早期凋亡的关键基因，并利用RNA干扰技术对关键基因进行功能研究。此项目从转录组水平上揭示杆状病毒诱导昆虫细胞发生早期凋亡的分子机理，寻求病毒的宿主范围决定因子，为科学利用和遗传改良杆状病毒奠定理论基础。

杆状病毒因能代替传统化学农药被视为安全的生物杀虫剂，最近研究表明细胞凋亡是限制杆状病毒宿主范围的重要因素。因此，杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡机理的研究对杆状病毒杀虫剂的开发有重要作用，对疾病研究也有一定的价值。斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltMNPV）能诱导甜菜夜蛾离体培养细胞（Se301）发生早期凋亡，其凋亡症状与典型的凋亡有明显不同，本申请项目以其作为研究模型。. 首先在转录组学水平上开发了一种包含SpltMNPV 所有ORF的寡核苷酸基因芯片及其相应的数据库；使用链特异性RNA测序（RNA-seq）的方法在感染细胞18小时中鉴定到99180个转录本。在感染时超过2000个斜纹细胞基因有明显变化。病毒mNRA从感染后6小时开始有明显增加，一直持续到18h。这些基因与凋亡，宿主细胞免疫系统和代谢酶等有关，并进行了KEGG代谢通路分析。. 其次构建病毒基因缺失突变体，研究差异基因中与SpltMNPV基因有一定同源性的ac30基因功能。结果表明:ac30的开放阅读框(ORF)全长为1392bp,GC 含量为43%,编码氨基酸463个,预计分子质量为54.7ku。从转染或感染的病毒生长曲线变化趋势来看,ac30的缺失对病毒产生有感染力的BV 粒子没有影响,说明ac30基因是AcMNPV 病毒在Sf9细胞复制中的非必需基因。. 最后在蛋白质组水平上，采用质谱定量研究技术ITRAQ研究AcMNPV感染Sf9细胞时的差异表达蛋白，结果显示与对照细胞相比，共鉴定并比对出4004个蛋白在表达上有明显差异，对所鉴定出来的4004个差异表达蛋白进行GO分析， 结果显示这些蛋白主要涉及到胞内过程、代谢过程、生物调节过程和单个组织。针对iTRAQ鉴定出来的Sf9细胞中的4004个有表达差异的蛋白质，将缺失p35的AcMNPV感染Sf9时表达差异蛋白与AcMNPV感染Sf9时的显著差异蛋白进行比较后，发现有226个蛋白是缺失p35的AcMNPV感染Sf9时特异性表达的。针对这226个蛋白进行了GO聚类和KEGG分析。此项目完成从转录组水平和蛋白组水平上揭示了杆状病毒诱导昆虫细胞发生早期凋亡的分子机理，寻求病毒的宿主范围决定因子，为科学利用和遗传改良杆状病毒奠定理论基础。. 相关研究成果已发表3篇SCI收录文章和1篇中文核心期刊收录文章。