杜鹃花R2R3型MYBs参与冷驯化并提高植株耐寒性的分子调控机制

Rhododendron spp. are one of the most famous ornamental shrubs in the world with a large variety of cultivars. However, cultivars commonly used in landscaping in China are limited. Low temperature is the main factor limiting the wide application of rhododendrons in China. From the screening of freezing tolerance in different rhododendrons cultivars, we found that ‘Elsie Lee’ is the most cold hardy one. Through the analysis of the transcriptome data before and after cold acclimation, find R2R3 MYB genes were highly upregulated. Here, we intend to determine their type, sequence characteristics, subcellular localization and transcriptional activation activity by the full-length cloning and comparative analysis of the MYB genes in rhododendron. The expression patterns of MYB genes will be analyzed under cold acclimation and normal growth conditions in different cold-resistant cultivars. Phenotypic analysis and functional identification will be performed on transgenic Arabidopsis thaliana. The downstream target genes will be screened by ChIP-seq on transgenic rhododendron, and whether their promoter sequences can be bound to MYBs will be verified both in vivo and in vitro. The expression of downstream target genes in cold-acclimation of rhododendron will be determined. So far, we could explore the molecular regulation mechanism of MYBs involvement in the cold-acclimation of rhododendron to improve its freezing tolerance. This study can not only enrich the theory of MYB transcription factors regulation of cold stress response, can also provide molecular reference for breeding cold-resistant rhododendron germplasm.

杜鹃花是世界著名的园林用观赏灌木，品种繁多，但我国园林绿化常用品种却十分单一。低温是限制杜鹃花品种在我国广泛应用的主要因素。对不同杜鹃花品种冬季耐寒性观测中，我们筛选出耐寒品种‘埃尔西·李’，通过分析其冷驯化前后转录组数据，找到差异表达显著的R2R3型MYBs基因。本研究拟通过对杜鹃花MYBs基因的全长克隆和比对分析，确定其类型、序列特性、亚细胞定位和转录激活活性；分析不同耐寒性品种中冷驯化和正常生长条件下，MYBs基因的表达模式；通过转化拟南芥进行表型分析和功能鉴定；转化杜鹃花后，利用ChIP-seq筛选下游靶基因，并在体内和体外对其启动子序列与MYBs转录因子的结合性进行验证；检测靶基因在杜鹃花冷驯化中的表达量变化。综合以上分析，探讨MYBs参与杜鹃花冷驯化提高植物耐寒性的分子调控机制。该研究不仅能丰富MYB转录因子调控冷胁迫响应的理论基础，还可以为选育耐寒杜鹃花种质提供分子参考。

杜鹃花是世界著名的观赏花卉，也是中国的十大传统名花之一。在我国，常绿杜鹃花（evergreen azalea）的品种主要分布在长江以南地区（冬季最低温度为 0oC 左右），冬季耐低温能力成为制约其广泛的园林应用的重要环境因素之一。因此，选择耐寒品种，并解析其耐寒性分子机理对培育耐寒性种质具有重要意义。从耐寒品种‘Elsie Lee’中克隆得到3个MYB基因，分别命名为RtMYB4，RtMYB9和RtMYB5，其中RtMYB9在冷胁迫下，表达量最高，变化也最明显。将其转入拟南芥后，在低温胁迫下，过表株系较野生型具有更强的耐寒性。利用高通量转录组数据，分析了常绿品种越冬叶片的冷驯化和脱冷驯化过程。发现光合作用、光保护作用和脂肪酸代谢路径在自然冷驯化中特异性富集；碳水化合物代谢、次级产物代谢和植物的生理节律路径在自然冷驯化和人工气候室冷驯化中普遍富集。越冬叶片在冷驯化过程中没有休眠，但需要光保护作用，且在脱冷驯化过程中不会伴随生长过程。利用Mfuzz分析，确定了冷驯化和脱冷驯化每个阶段的具体生物过程；通过WGCNA分析，提出了共表达基因网络及基因与生理生化变化的关系。我们发现，昼夜节律在提高叶片耐寒性上起着重要作用。冬季昼夜节律相关基因的大量表达可能与糖分的积累有关。此外，常绿叶片在越冬过程中表现出强烈的光保护能力，即较高的非光化学淬灭，光早期诱导蛋白(Early Light-induced proteins, ELIPs)基因的大量表达，以及类囊体的去垛叠。这些现象在脱冷驯化过程中逐渐得到缓解。叶片对光保护作用的强烈需求可能是冷驯化过程中脱落酸和茉莉酸含量下降的原因。此外，冷驯化过程中脱落酸和茉莉酸含量的下降可能导致了木质素含量的下降。本研究为常绿木本植物越冬过程的分子机制提供了新见解，对促进木本植物耐寒性的研究有非常积极的意义，并为利用基因工程手段定向选育更加耐寒的常绿木本观赏植物提供方向和参考。