GEF-H1介导TLR4信号通路在内毒素损伤血管内皮细胞中的作用

本研究在建立体外培养单层肺血管内皮细胞模型的基础上，观测LPS刺激后内皮细胞内GEF-H1表达变化；同时测定细胞通透性和细胞阻抗的变化，并且利用Western blot和激光共聚焦显微镜等技术对细胞粘附连接的蛋白（Adherens Junction）组成、含量和分布进行研究，以确定LPS对细胞粘附连接蛋白、细胞通透性的损伤作用。通过抑制GEF-H1的表达，探讨GEF-H1在介导LPS损伤粘附连接和细胞通透性中的作用；利用动态荧光共振能量转移技术（FRET）和免疫共沉淀等方法分析GEF-H1与TLR4的相关性，确定以GEF-H1为关键环节的LPS信号传递通路。利用基因干扰技术，在体内外抑制GEF-H1的表达，以探讨减轻LPS造成血管内皮细胞损伤的可能性。研究结果有助于深入了解感染造成血管通透性增加和组织水肿的机理；并可能为临床上干预感染造成的损伤提供潜在的手段。

目的 本项研究的目的是研究在LPS活化的血管内皮细胞中GEF-H1/RhoA 信号途径在调节多种炎症介质的表达以及血管内皮细胞通透性变化中的作用。实验方法 以脐静脉内皮细胞（HUVECs）为研究对象，采用siRNA抑制GEF-H1的表达或特异性阻断剂降低ROCK、p38以及ERK1/2等的活性，采用免疫印渍、PCR、ELISA及Transwell等分子生物学实验方法检测HUVECs炎症因子的表达及通透性的变化情况。结果 免疫共沉淀结果显示LPS诱导TLR4和GEF-H1形成信号转导复合物，活化RhoA，最终上调NF-κB的转录活性和细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-8和ICAM-1）的表达。虽然抑制TLR4或MyD88的表达均能显著性抑制NF-κB 转录活性，但是抑制MyD88的表达并未降低LPS诱导的RhoA活性。同时抑制p38和GEF-H1或RhoA对LPS诱导的NF-κB转录活性的抑制和单独抑制p38之间没有显著性差异。抑制GEF-H1、RhoA或ROCK均不仅能显著抑制LPS诱导的内皮细胞p38、ERK1/2和NF-κB的磷酸化水平，而且能显著抑制LPS 刺激引起的血管内皮细胞内MLC 和MYPT1 磷酸化水平、血管内皮细胞微管蛋白去乙酰化增加、胞内聚合态微管蛋白减少以及MAP4 磷酸化水平增加；减轻由LPS 导致的胞内应力纤维形成、紧密连接蛋白和粘附连接蛋白丢失；最终降低LPS 刺激引起的Transwell 下室中EB-Albumin OD 值增加。结论 研究结果提示血管内皮细胞中GEF-H1/RhoA/ROCK通过非MyD88依赖性途径介导LPS诱导的p38和ERK1/2活化, 最终激活NF-κB转录活性和上调IL-6、TNF-α、IL-8和ICAM-1多种炎症介质的表达。同时LPS 可以通过活化p38/MAPK 途径下调MAP4 活性, 导致血管内皮细胞微管解聚，GEF-H1/RhoA 信号通路介导LPS 引起的血管内皮细胞通透性改变。