超高分辨率光学-冷冻电子显微成像技术解析CRAC通道的三维结构

钙释放诱发的钙通道(CRAC)在骨骼肌收缩、卵母细胞的受精、免疫细胞的基因表达以及免疫细胞的分泌等过程中起重要作用，但其分子机制一直不甚清楚。有研究表明位于细胞质膜上的Orai1蛋白是 CRAC 通道的重要组成部分，而定位在内质网上的STIM1蛋白是CRAC 通道开放的必要条件之一。我们以前的工作已经解决了 STIM1 和 Orai1 的动态变化、相互作用区域和分子组成等一系列科学问题，但CRAC通道在原位状态下高分辨率的三维结构还没有人知道。在本项目中，我们将发展超高分辨率光学显微（PALM）与冷冻电子显微（Cryo-EM）联用技术，在细胞原位研究CRAC通道的三维结构，为进一步研究其功能提供结构依据。

显微镜技术是生物学研究中应用最广泛的技术之一，光电联合显微成像技术的出现使得研究人员能够在更广的尺度和更高的精度上。为了极大限度的保证样品处于自然状态，我们探索了在深冷环境下进行超分辨荧光成像并进行深冷光电联合成像。. 我们首先搭建了能够在超低温下进行高分辨成像的光学平台，并在此平台下研究了普通荧光蛋白和光转化荧光蛋白的性质。利用哺乳动物细胞HEK293 tomo20 dronpa的冷冻含水切片样品，在进行了深冷光镜成像后，被转移到冷冻电镜中进行三维断层成像。为实现光电图像的关联，我们在样品中预先加入合适浓度的红外荧光珠和金颗粒作为参照物，利用自主开发的一套光电图像配准的程序，成功实现了对同一细胞同一位置的深冷超分辨原位观察，且配准误差小于20 nm。