乙醇发酵途径中关键调节蛋白RSP的X光结构和功能研究

Due to increasing energy consumption worldwide and limited crude oil supply, the need for alternative energy source such as bioethanol produced from cellulose has drawn enormous attention.Thermophilic anaerobes are of great interent in ethanol fermentation for their broad metabolic phenotype, easy for ethanol recovery and minimizing microbial contamination. However, the production of high ethanol yields are typically lacking in thermophilic anaerobes. Metabolic engineering has emerged as a powerful tool for the improved production of bioethanol.Thermoanaerobacter ethanolicus has been well studied, in which a redox-sensing protein (RSP) plays a key role in ethanol metabolic pathways and hence is an essential target for metabolic engineering.In this study, we plan to resolve the crystal structures of RSP in apo-form and in complex with three ligands, NAD+,NADH or DNA.These structurs will provide the binding mode of RSP and ligands. The key binding residues in RSP will be the essential target for metabolic engineering. This study will elucidate at the molecular level how ethanol metabolism is regulated by RSP so that strategies can be developed to increase the final ethanol concentration.

随着地球资源能源的匮乏，开发利用纤维素等可再生资源生产生物乙醇已经迫在眉睫。嗜热厌氧菌进行乙醇发酵具有底物水解谱广泛，乙醇回收简单，抑制微生物污染等明显的优势，但通常乙醇产量较低。利用代谢工程改造是提高乙醇产量的重要手段。Thermoanaerobacter ethanolicus是研究较为透彻的产乙醇嗜热菌，还原力感应蛋白RSP在该菌乙醇发酵途径中起到枢纽作用，是代谢工程改造的重要靶点。本课题拟利用X光晶体学的方法，解析RSP及其与NADH、NAD+、DNA复合物的分子结构，利用结构信息和定点突变手段构建突变体，分析验证RSP与小分子、DNA的结合模式和关键作用位点，挖掘代谢工程改造的潜在靶点。本研究旨在从分子水平上解释RSP对乙醇发酵途径的调控机制，为采用代谢工程改造来提高乙醇发酵产量提供理论指导。

随着地球资源能源的匮乏，开发利用纤维素等可再生资源生产生物乙醇已经迫在眉睫。嗜热厌氧菌进行乙醇发酵具有底物水解谱广泛，乙醇回收简单，抑制微生物污染等明显的优势，但通常乙醇产量较低。利用代谢工程改造是提高乙醇产量的重要手段。Thermoanaerobacter ethanolicus 是研究较为透彻的产乙醇嗜热菌，还原力感应蛋白RSP在该菌乙醇发酵途径中起到枢纽作用，是代谢工程改造的重要靶点。本课题利用X光晶体学的方法，解析RSP及其与NADH、NAD+、DNA复合物的分子结构，利用结构信息和定点突变手段构建突变体，分析验证RSP与小分子、DNA的结合模式和关键作用位点，挖掘代谢工程改造的潜在靶点。.好氧菌Rex家族的抑制剂通过结合NADH或者NAD+来感应环境中还原力的大小，从而调节菌的好氧呼吸。而与Rex蛋白不同的是，RSP在专性厌氧菌T. ethanolicus中控制乙醇发酵的过程，在其它厌氧生物中也有类似的酶被发现。我们首次解析了专性厌氧菌来源的氧还感应蛋白RSP及其复合物RSP/NADH、RSP/NAD+/DNA的结构。结果表明，RSP通过同源二聚体的形式发挥功能，当结合DNA操纵子时，RSP成open结构，当从DNA上脱离时，则呈closed结构。双链DNA结合到RSP蛋白的N端翅形螺旋结构域中，还原型或氧化型的二核苷酸则结合到C端Rossman结构域中。二核苷酸的烟酰基在NADH和NAD+中分别采取反式和顺式构象。因此，NADH的结合导致RSP采取closed的构象，不能结合DNA。RSP中的保守氨基酸残基和所结合DNA的偏好性均与好氧菌来源的Rex不同，表明好氧和厌氧来源的Rex家族成员发挥感应还原力的生理功能具有不同的结构基础。.本研究从分子水平上解释了RSP对乙醇发酵途径的调控机制，为采用代谢工程改造来提高乙醇发酵产量提供理论指导。