ILS介导JH/20E激素调控家蚕抗菌肽表达的研究

The recent studies on Drosophila melanogaster had revealed that starvation could regulate the expression of antimicrobial peptides (AMPs) by activating the FOXO transcription factor through the insulin-like signaling (ILS) pathway. Juvenile hormone (JH) and 20-hydroxyecdysone (20E) were found to control AMPs expression in both Drosophila and silkworm (Bombyx mori), while the regulation mechanism is still unknown. JH/20E titer and ILS levels are closely related, altering each other in insects. In this project, we will aim at solving two scienetific questions. Firstly, what's the relationship between starvation or JH/20E and ILS level in silkworm? Secondly, does hormone JH/20E regulate the expression of antimicrobial peptides mediated by the ILS-FOXO pathway? Experiments will be performed to uncover the hormonal regultion mechanism of antimirobial peptides in Bm-12 cells by the dual luciferase assay, RNAi and Western blot. The results will provide a scientific basis to explore the relationship between nutrition, immunity and development, and to improve the knowledge of the insect innate immunity.

最近对果蝇（Drosophila melanogaster）的研究揭示，饥饿信号能够通过类胰岛素信号（insulin-like signaling，ILS）途径中的转录因子FOXO调控某些抗菌肽的表达。同时，在果蝇和家蚕（Bombyx mori）中保幼激素（JH）和蜕皮激素（20E）能够诱导某些抗菌肽的表达，但激素调控抗菌肽的机理尚不清楚。昆虫激素JH/20E水平和ILS水平相互影响、密切相关。据此，我们提出本项目的科学问题：（1）饥饿与JH/20和家蚕ILS水平的关系如何？（2）JH/20E是否通过ILS-FOXO调控抗菌肽的表达？本研究将以家蚕细胞Bm-12为对象，采用双荧光素酶检测、RNAi、Western blot等技术手段，探讨JH/20E和饥饿通过ILS调控抗菌肽表达的分子机制。本项目研究对理解昆虫的营养、免疫与发育之间的关系，完善昆虫的先天免疫认识，有重要的科学意学意义。

感染条件下，以果蝇为代表的昆虫对病原菌的识别和信号传导机制已经研究得非常深入。但营养条件、饥饿等非感染因素的刺激对昆虫免疫机制的影响，研究报道还很少。近年在果蝇中的研究揭示饥饿信号能够通过类胰岛素信号（insulin-like signaling，ILS）途径中的转录因子FoxO调控某些抗菌肽的表达；20E也能促进果蝇抗菌肽的免疫应答，提高抗菌肽的表达。本项目研究饥饿和20E处理家蚕，通过检测抗菌肽的表达和胰岛素信号水平的变化，探讨饥饿和激素对抗菌肽表达的调控机制。研究结果发现：（1）适当的饥饿处理可以提高家蚕血淋巴的抑菌活性，qRT-PCR的结果显示多个抗菌肽的表达上调，其中以defensinB、cecropinB6的上调最为显著。饥饿处理的家蚕细胞Akt磷酸化程度明显下降，可见饥饿抑制了ILS转导通路。通过双荧光素酶报告实验分析启动子活性，发现饥饿处理后正常defensinB启动子的活性明显上调，而缺失FoxO结合位点的启动子对饥饿处理不敏感。在家蚕Bm-12细胞中过表达FoxO-GFP融合蛋白，饥饿促使FoxO激活进入细胞核。RNAi的研究结果表明干扰InR后的家蚕脂肪体中抗菌肽基因defensinB表达上调。结论：饥饿通过降低家蚕ILS水平激活下游转录因子FoxO，使FoxO进入细胞核进而调控相关抗菌肽基因的表达。（2）20E处理家蚕导致抗菌肽基因BmcecB6、胰岛素受体基因BmInR表达量显著上调；而Akt磷酸化水平明显下降，说明20E抑制了ILS通路水平，暗示ILS下游的转录因子FoxO被激活。对BmcecB6上游调控区域的分析发现存在 5个可能的FoxO结合位点，采用重叠PCR获得缺失所有FoxO结合位点的启动子序列，双荧光素酶报告载体分析结果显示20E处理后野生型和缺失突变型BmcecB6启动子的转录活性均显著增强，且20E对两者的诱导活性没有显著差异，提示缺失FoxO结合位点对20E调控BmcecB6的表达没有显著性影响。进一步对BmcecB6的启动子进行截短分析，发现响应20E的顺式作用元件在-630~-170区间。上述结果暗示 FoxO与蛋白因子的复合物结合在BmcecB6 -630~-170区域的顺式元件来响应20E对抗菌肽的表达进行调控。本项目研究结果对理解昆虫的营养、免疫与发育之间的关系，对完善昆虫的先天免疫认识有重要的科学意义