新的基于代谢途径重构技术产丙烯酸工程菌的构建及代谢调控

丙烯酸作为化工基础原料，是一种重要的三碳平台化合物，目前均采用化学法以石化产品为原料生产。本课题提出一种新的基于途径重构技术的微生物生产丙烯酸的方法，构建基因工程菌将乳酸与丙烯酸代谢途径重组，从而利用糖类物质生产丙烯酸，以减少对石化资源的依赖。本研究以克雷伯氏杆菌为对象，首先采用增强乳酸代谢途径及敲除副产物2，3-丁二醇代谢途径的方法，提高NADH的利用率，从而提高乳酸产量；然后在重组菌中表达乳酸转化为丙烯酸的关键酶- - CoA-转移酶及乳酰-CoA脱水酶，将乳酸代谢为丙烯酸，并分析增强、敲除代谢途径及表达外源蛋白对细胞代谢的影响；同时采用全局转录机器工程（gTME）的新方法，构建σ因子突变库在DNA转录水平上对细胞进行代谢调控，筛选正向突变株，利用定量PCR、二维电泳及质谱技术分析细胞的转录、翻译水平及代谢流量差异，最终获得生产丙烯酸的基因工程菌并在分子水平上阐明其代谢调控机理。

丙烯酸是重要的化工基础原料之一，也是一种重要的合成树脂单体，广泛应用于化工、轻工、纺织、建材和医药行业，目前主要以石化产品为原料生产。本课题的研究方向是构建一种新的基因工程菌，基于途径重构技术，将乳酸与丙烯酸代谢途径重组，从而利用糖类物质等可再生资源进行生物法生产丙烯酸，以减少对石化资源的依赖。本研究以克雷伯氏杆菌为对象，研究了基因敲除及过表达对代谢途径及产物的影响，首先采用增强乳酸代谢途径及敲除副产物2，3-丁二醇代谢途径的方法，提高NADH的利用率，从而提高乳酸产量；构建了基因敲除载体pTBT及基因表达载体pKP-ldhA，转化克雷伯肺炎杆菌K. pneumoniae，得到的重组菌K. pneumoniae B-L+经基因组PCR及SDS-PAGE分析，其丁二醇合成酶基因被敲除，D-乳酸脱氢酶基因得到过量表达。K. pneumoniae B-L+的乳酸代谢能力增强，经摇瓶发酵后，丁二醇产量比原始菌降低了90%，D-乳酸产量比原始菌提高了41.4%。在5 L发酵罐中发酵56 h后，乳酸产量达到68.4 g/L，底物转化率为78%，平均生产强度为1.22 g/L•h。其次，克隆了来自于丙酸梭菌的CoA-转移酶（PCT）及乳酰-CoA脱水酶（LCD）基因，采用随机引物和简并引物相结合的方法，得到了丙酸梭菌中编码乳酰-CoA脱水酶基因的完整序列，提交至Genbank数据库中，并对其进行了结构分析，序列长3182bp，包含三个开放阅读框，编码的三个亚基分别由251，422和374个氨基酸组成，理论分子量分别为27kDa，47kDa和41kDa。分别构建了表达载体pET-28a（+）-lcd+pct和pK-28a-lcd+pct，分别转化大肠杆菌和克雷伯氏杆菌，研究了重组蛋白的表达情况，重组菌能够有效的表达CoA-转移酶及乳酰-CoA脱水酶，但丙烯酸无法实现有效积累，主要原因是中间产物丙烯酰-CoA对细胞的毒性较大，因此在体外进行了细胞破碎液双酶催化转化实验，乳酸至丙烯酸的转化率达到40%，初步实现了生物法生产丙烯酸的目标，为后续的研究奠定了基础。本项目发表论文7篇，其中SCI收录1篇，基本完成了项目计划的主要内容。