丹参经表观遗传调控Nrf2/ARE通路及降低核苷酸类似物肾毒性的作用机制研究

The purpose of herb drug combination is to exert the synergistic effect as well as attenuate side effect. Revealing the underlying will provide a scientific basis for clinical use. Our previous studies showed that Salvia miltiorrhiza (danshen) extract could decrease the nephrotoxicity of adefovir, a nucleotide analog antiviral medicine. The induction of MRP4 expression via Nrf2/ARE pathway leading to enhanced efflux of adefovir in renal proximal epithelium could be a potential mechanism. In this proposal, the following experiments will be carried out to identify the exact mechanisms. The luciferase reporter gene system and chromatin immunoprecipate techniques will be utilized to verify the regulatory effect of Nrf2 on MRP4 through binding the ARE in MRP4 promoter. The methylation DNA immunoprecipitation and bisulfite genomic sequencing method will then be applied to investigate the epigenetic regulation of Nrf2 by Salvia miltiorrhiza extract as well as the active components in renal proximal cells. Based on the results of the above in vitro studies, the cellular efflux as well as in vivo efficacy study using both normal mice and Nrf2(-/-) mice will be performed to validate our findings of reducing nephrotoxicity of adefovir by co-administration of Salvia miltiorrhiza. The outcome from the current project will not only provide the scientific evidence of Salvia miltiorrhiza effect on reducing toxicity, but broaden the area of future application of herb-drug combination.

中西药联用的临床目的在于增效减毒，揭示联用时"增效减毒"的分子机制则有助于为临床用药提供科学依据。本课题组的前期研究结果初步提示，丹参具有潜在的降低核苷酸类似物(PNAs)肾毒性的作用。为揭示该现象产生的机理，本项目在已有的工作基础上，围绕丹参是否通过影响Nrf2/ARE信号通路，继而诱导MRP4的表达，减少肾小管上皮细胞的药物蓄积，实现对PNAs肾毒性的减毒作用开展研究。研究工作选择阿德福韦为PNAs的代表，采用报告基因系统、染色质免疫共沉淀等方法，揭示Nrf2调控MRP4的机理；应用DNA甲基化免疫沉淀和亚硫酸氢盐测序技术探索丹参对于肾上皮细胞中Nrf2的表观遗传调控机制；结合细胞摄取实验和基因敲除的动物模型，宏观呈现联用状态下，药物外排率及对小鼠肾功能的影响。研究工作将揭示丹参降低PNAs肾毒性的作用机制，为丹参与PNAs联用提供科学依据，也为中西药联合应用的分子机制研究开阔思路。

阿德福韦酯（Adefovir Disoproxil, ADD）是嘌呤核苷类抗病毒长期治疗的首选药物，由于ADD的活性代谢物主要由肾脏排泄，在长期用药过程中，常引起肾小管坏死和间质纤维化。对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）是市售OTC类抗感冒药最主要的活性成分，患者在缺乏用药知识时，常常会误服多种含同样组分的抗感冒药，造成APAP过量服用，从而引起严重肝肾毒性的主要原因。药物在组织中的蓄积是ADD和APAP产生肝肾毒性的前提，药物的蓄积程度与组织中相关转运体的表达密切相关，而基因的表达又受相关核转录因子的调控。本项目主要围绕丹参酮IIA（Tanshinone IIA，TAN IIA）能否通过核转录因子Nrf2- MRP2/4通路降低ADD和APAP的肝肾毒性开展实验，并深入探索其作用机制。.研究工作首先通过动物实验证明了长期联用丹参能够明显逆转ADD对血清肌酐的降低及对血清无机磷的升高作用，并能明显改善ADD造成的肾组织形态学病变情况。接着构建了Nrf2沉默的肾小管上皮细胞模型（Nrf2-KD HK-2），证明了丹参仅在Nrf2存在时才能诱导细胞中MRP4的表达，从而降低阿德福韦的细胞蓄积。进一步在动物实验中验证了丹参能够诱导肾组织中Nrf2-MRP4通路的表达，从而降低ADE的蓄积。.同样，通过动物实验证明了TAN IIA能够降低APAP对肝肾功能生化指标的升高作用，并明显改善APAP造成的肝肾组织形态学病变情况，同时对肝肾组织中Nrf2和Mrp2/4有明显诱导作用。药动学实验结果表明TAN IIA降低了APAP的t1/2、Vz以及其毒性代谢物NAPQI的AUC，减少了NAPQI在肾组织中的暴露量，增强了其胆汁排泄。接着利用Nrf2敲除鼠证明在Nrf2缺失时，TAN IIA对肝肾组织的保护作用降低，且对Mrp2/4的诱导作用也降低。报告基因和染色质免疫共沉淀实验证明Nrf2能够与MRP2/4启动子区相关ARE序列结合。最后通过细胞实验证明TAN IIA能够通过抑制HOTAIR的表达来实现对Nrf2-MRPs通路的表观遗传激活作用。.研究工作揭示了丹参降低ADD和APAP肝肾毒性的机制，为中西药联合应用的分子机制研究开阔了思路，研究结果为ADD和APAP的临床应用提供了有益的信息，也为丹参或TAN IIA的临床应用提供了科学依据。.