酿酒酵母Cip1调控细胞周期G1/S转换的分子机制研究

The accurate transition from G1 phase of the cell cycle to S phase is crucial for the control of eukaryotic cell proliferation, and its misregulation promotes oncogenesis. G1-CDK is the master kinase for the regulation of G1/S transition, the general mechanism for which is highly conserved from budding yeast to human cells. We have reported that Cip1 is a novel inhibitor for G1-Cdk1 in Saccharomyces cerevisiae, and is a homolog protein to tumor suppressor p21. Recently, we detected that Cip1 is phosphorylated once cells cross the START point. We also identified that Cip1 interacts known G1/S regulators including Whi7. In addition, we found that a dual role of Cip1 in G1/S transition through G1-Cdk1 inhibition and G1-Cdk1 independent pathways. To explore the molecular mechanisms of Cip1 in G1/S transition, we will determine the role of Cip1 phosphorylation and the interaction with Whi7 regarding G1/S transcriptional regulation and clarify the dual functions of Cip1 regulating G1/S transition through genetic and biochemistry assays. We believe this project will fully elucidate the role of Cip1 in G1/S transition and its underlying mechanisms, which will further promote our understanding of G1/S checkpoint control and its importance for eukaryotic cell proliferation.

细胞周期G1期到S期的精确转换是真核生物细胞增殖调控的关键。G1-CDK是G1/S转换的关键激酶，其调控规律从酿酒酵母到人高度保守。申请者发现酿酒酵母Cip1蛋白能特异性抑制G1-Cdk1的活性，其编码基因与人类抑癌基因p21功能同源。本项目前期研究表明：细胞跨过G1/S检验点，Cip1即被磷酸化；Cip1与G1/S检验点调控蛋白Whi7等发生相互作用。同时还发现Cip1调控G1/S转换可能通过抑制G1-Cdk1和不依赖G1-Cdk1的双重通路。因此，本项目拟从分子水平重点探讨Cip1磷酸化修饰以及Cip1与Whi7等蛋白质的相互作用，通过遗传和生化等技术多方面探索Cip1调控G1/S转换的双重通路，以期揭示Cip1蛋白调控细胞周期G1/S转换的分子机制，这有助于进一步阐明真核生物G1/S检验点对细胞增殖调控的重要作用。

细胞周期调控是维持细胞正常增殖和基因组稳定的核心与基础。细胞周期G1/S检验点是监测细胞是否进入分裂周期，决定DNA复制起始的重要关卡。本课题组前期鉴定酿酒酵母一个新蛋白YPL014W参与细胞周期G1/S转换，将其命名为Cip1。.Cip1蛋白特异性结合G1期Cln3-Cdk1复合体，并抑制其活性。本课题研究发现敲除Cip1蛋白已知底物Cln3并不能挽救Cip1过表达导致的细胞周期阻滞，推测Cip1可能还有其它底物。通过免疫印迹及qPCR比较cln3△突变体和cln3△ cip1△突变体中S期标志基因CLN2的表达情况，发现cln3△ cip1△突变体细胞更早进入S期。该结果进一步证明细胞周期G1/S转换过程中，Cip1具有不依赖于Cln3-Cdk1的另一条调控通路。.为寻找Cip1另一调控通路靶蛋白，本研究结合免疫共沉淀和质谱鉴定筛选分析Cip1相互作用的一系列新蛋白。通过对Cip1互作蛋白的功能注释，利用酵母双杂和免疫共沉淀验证，证明Ccr4-Not复合物的两个亚基Ccr4和Caf120均与Cip1蛋白相互作用。并且发现Cip1同功能蛋白p21和人Ccr4也有类似相互作用。互作蛋白质筛选表明酵母和人细胞Ccr4蛋白是Cip1/p21另一调控通路的候选新靶标。.本课题证实Cln3和Ccr4同时缺失存在合成致死的遗传学效应，表明Ccr4与Cln3位于两条并行通路参与调控细胞周期G1/S转换。此外，本研究发现分别过量表达Cln3或Caf120部分回复Cip1过表达导致的细胞生长缺陷，表明Cip1负调控Cln3和Ccr4两条并行通路。Whi5（Rb同源蛋白）是已知的G1/S转录阻遏蛋白，其活性分别受Cln3和Ccr4调控。本研究发现敲除WHI5可以挽救Cip1过表达导致的细胞周期阻滞。综上所述，Ccr4和Cln3是共同抑制Whi5的两条并行途径，受Cip1负调控。此外，通过突变体遗传学分析和酵母双杂检测，初步推测Thr135是Cip1一个重要的磷酸化位点。.本研究证明Cip1充当双重阻遏物，负调控Cln3-Cdk1和Ccr4-Caf120复合物，从而保持Whi5活跃，阻断SBF介导的G1/S基因转录。Cip1调控细胞周期G1/S转换工作模型的新发现推进了对真核生物细胞周期调控机制的认识，也为深入研究人类抑癌分子机制提供理论基础和新思路。