Aurora B磷酸化修饰TRF1在急性白血病发病过程中的作用及分子机制研究

In most human cancer cells which including leukemia cells, telomere length is maintained by the de novo addition of telomere repeats by telomerase. Some telomere-localizing proteins form a large complex termed the "shelterin/telosome",which is important for regulating telomeric structure and function. The first mammalian telomeric protein, now referred to as TRF1,was isolated based on its in vitro specificity for double-stranded TTAGGG repeats typical of vertebrate telomeres.TRF1 negatively regulates telomerase-dependent elongation, but how the TRF1 protein is involved in telomere length maintenance remains unclear. Our previous studies show that Aurora B is a novel TRF1-interacting protein.Aurora B can phosphorylate TRF1 in vivo and in vitro.In this study,we will try to further narrow down the phosphorylation site of TRF1 by Aurora B, and demonstrate the precise molecular mechanism and function of Aurora B-mediated phosphorylation in both TRF1 overexpression-induced apoptosis and its telomeric DNA regulating ability.This study will contribute to a better understanding of acute leukemia development mechanism and will provide new evidence that targeting TRF1 may be a promising therapeutic strategy for acute leukemia patients.

包括急性白血病在内的绝大多数肿瘤细胞通过激活端粒酶而弥补随细胞分裂逐渐缩短的端粒长度以获得永生。端粒长度受到多种蛋白质的调控，TRF1是第一个被发现的具有端粒长度负向调控作用的蛋白质，但其调控端粒长度的具体分子机制还有待于深入研究。本课题组在前期研究中发现了一个新的TRF1相互作用蛋白Aurora B，也证实了Aurora B在体外能够磷酸化修饰TRF1。本项目拟在前期工作基础上，鉴定TRF1的Aurora B磷酸化修饰位点，通过体内、体外磷酸化实验研究明确Aurora B激酶对TRF1的磷酸化修饰，观察Aurora B磷酸化修饰TRF1对TRF1功能及端粒长度的影响，并采用一系列细胞模型及动物实验进一步阐明Aurora B 磷酸化修饰TRF1在急性白血病发病过程中的作用及具体分子机制。研究结果将可能有助于进一步阐明急性白血病的发病机制，并有望发现新的急性白血病预后标志和治疗靶点。

TRF1是第一个被发现的具有端粒长度负向调控作用的蛋白质，最近研究发现，TRF1能够参与细胞有丝分裂期染色体正常分离的调控，提示TRF1 可能在细胞有丝分裂与端粒之间扮演着关键信号调控分子的角色。本项研究综合采用分子生物学手段，系统研究了TRF1蛋白在细胞有丝分裂期的磷酸化修饰，鉴定出Aurora B是一个新的TRF1相互作用蛋白，生化实验验证了Aurora B与TRF1在体内外均有相互结合，体内外磷酸化实验鉴定出TRF1第417位丝氨酸是Aurora B磷酸化修饰TRF1的具体位点，免疫荧光实验及活细胞实时显像实验显示Aurora B磷酸化修饰TRF1对于细胞有丝分裂期染色体正常分离是必须的。本项研究为细胞周期调控与端粒长度之间的相互调节提供了新的研究线索。相关成果已发表SCI文章6篇，其中第一作者2篇，通讯作者3篇，中文文章2篇，具体如下：.1.TRF1蛋白在细胞有丝分裂期新的磷酸化位点的鉴定： 收集利用Nocodazole阻断在M期的THP-1细胞，通过免疫共沉淀分离TRF1蛋白，蛋白质质谱分析鉴定出第417位丝氨酸是一个新的TRF1磷酸化位点，生物信息学预测得知第417位丝氨酸可能是一个新的Aurora B磷酸化位点。.2.研究Aurora B和TRF1相互作用及机制： 通过生化实验证实了Aurora B和TRF1在体内外能够相互结合，且鉴定出此种相互作用依赖于Aurora激酶C端的激酶结构域，磷酸化实验证实Aurora B能够磷酸化修饰TRF1第417位丝氨酸。.3. 研究Aurora B磷酸化修饰TRF1对调控端粒长度的影响及其机制： 构建了TRF1野生型、S417非磷酸化和S417模拟磷酸化突变体的稳定表达细胞株，TRAP及TRF法分析研究显示TRF1野生型、S417A稳定表达细胞株较S417E稳定表达细胞株相比端粒酶活性低、端粒长度短，提示Aurora B能够通过磷酸化修饰TRF1参与端粒长度调控。.4. 研究Aurora B磷酸化修饰TRF1进而调控染色体分离的机制： 生化实验研究显示Aurora B磷酸化修饰TRF1发生在细胞有丝分裂期，免疫荧光实验及活细胞实验显示过量表达TRF1 S417去磷酸化突变体会导致明显的染色体排列异常，而过量表达TRF1野生型及S471模拟磷酸化突变体则不明显。