B细胞抗体多样化过程中DNA损伤修复因子53BP1的作用机制研究

B-lymphocytes generate a diverse antibody repertoire to recognize the numerous pathogens. Antibody diversification processes involve programmed DNA breakage, rearrangement and/or mutations. Antibody class switch recombination (CSR) allows antibody to switch from IgM to other Immunoglobulin (Ig) isotypes, and is initiated by a B cell specific Activation-Induced Deaminase (AID). The deamination products on genomic DNA are processed into double-strand breaks (DSBs), which further activate the ATM-dependent DSB response (DSBR) pathways including 53BP1, H2AX and others. Amongst the DSBR factors, 53BP1 deficiency causes the most severe CSR defects in B cells. The Meng Lab has dissected the roles of 53BP1 in CSR using CRISPR/Cas9 gene editing tools and revealed an unknown aspect of 53BP1 beyond the classic DSBR function. In this proposal, the Meng lab plans to test these hypotheses, including whether 53BP1 affects AID recruitment to antibody genes and/or whether 53BP1 is involved in single-strand DNA break response and processing. By combining this study with studies of different 53BP1 mutants, the Meng lab aims to get a comprehensive understanding of the function of 53BP1 beyond DSBR. Eventually, the Meng lab proposes to use a genome-scale CRISPR/Cas9 knockout library to screen for new players in the 53BP1 pathway. The proposed project will use antibody CSR system to study 53BP1’s function beyond DSBR, which would extend our knowledge on DSBR factors. The uncovered mechanism and factors could reveal targets for immunodeficiency/cancer diagnosis and treatment.

在B细胞介导的免疫应答中，抗体基因经历程序性DNA断裂、重排和突变等一系列过程，编码抗原特异性的抗体分子。因此，DNA损伤修复系统是抗体类型转换过程所必需。与其它双链DNA损伤应答因子相比，53BP1在抗体类型转换中具有格外关键的作用，但其分子机制尚不清楚。申请人在前期工作中利用基因组编辑工具剖析了53BP1在抗体类型转换中的多面性，发现53BP1拥有独立于经典双链DNA损伤应答的未知功能。本课题拟通过遗传学、免疫学和功能基因组学方法研究53BP1的未知功能。本项目先将验证去氨酶招募和单链DNA损伤应答处理等设想；接着将结合该蛋白自身功能结构域信息，对可能通路进行分子机制研究；最后，还将利用小鼠全基因敲除库筛选53BP1功能相关因子，延伸我们对抗体多样化的认识。本项目通过抗体类型转换这一体系探究53BP1新功能及其通路上的新因子，可能为原发性免疫缺陷以及癌症的诊断和治疗提供新的精准靶点。

多样化抗体分子构成的抗体免疫库是机体体液免疫系统抵御外界病原体入侵的分子基础。在B淋巴细胞中，抗体基因需经历程序性DNA断裂、重排和突变等一系列DNA损伤过程，产生编码抗原特异性的抗体分子。在这一过程中，DNA损伤修复系统发挥了至关重要的作用。53BP1是染色质上DNA损伤应答通路的关键抉择因子，通过与其通路上其它蛋白的协同在抗体类型转换中发挥至关重要的功能。. 在本项目的资助下，项目团队对53BP1及其通路中的因子在抗体多样化中的功能进行了全面解析，并拓展研究了新型DNA损伤修复因子在抗体多样化中的功能。首先，我们解析了53BP1蛋白在抗体多样化中的功能机制，发现53BP1既在双链DNA损伤修复又可能在双链DNA断裂转化中发挥功能。其次，我们全面地剖析了53BP1下游REV7蛋白在抗体多样化中的功能，发现REV7蛋白在DNA双链断裂应答中抑制双链DNA断裂切除，促进了抗体类型转换；在跨损伤修复中促进碱基颠换，促进抗体高频突变中序列多样化；在脱碱基位点修复中帮助细胞容忍脱氨酶AID造成的DNA损伤并完成激活态B细胞细增殖。最后，我们通过遗传学筛选发现了非同源末端连接通路的新因子ERCC6L2，对其在抗体多样化中的研究进行了深入研究，发现其是非同源末端连接通路的关键组分，揭示了抗体类型转换中DNA双链断裂方向特异性连接的分子基础。. 本项目资助所产生研究成果已发表在Cell Res、Nat Commun等期刊。我们这些研究结果阐明了53BP1及其通路中REV7因子在抗体多样化中的作用机制，有利于我们深入地认识免疫缺陷、淋巴瘤等疾病的发病原理。