Exocyst复合体在SNARE介导的分泌囊泡与细胞膜融合过程中的功能及其机制研究

The interactions between intracellular organelles of the secretory and endocytic pathway are mainly mediated by vesicle trafficking. Vesicle trafficking occurs in four steps including vesicle biogenesis, transport, tethering and fusion with the target membrane, in which tethering is mainly mediated by MTCs (multi-subunit tethering complexes) and fusion by the SNARE machinery. While it is clear how SNARE mediates membrane fusion, it’s largely unclear about its regulation and the coupling between vesicle tethering and membrane fusion. Previous studies have shown that the subunits of the exocyst complex, the MTC in exocytosis, interact with SNARE proteins, implying that the assembled exocyst complex is also involved in SNARE-mediated membrane fusion. To uncover the function of the exocyst complex in membrane fusion as well as its mechanism, we will detect the interactions between the exocyst complex and SNAREs/SNARE complexes, and solve the structures of the exocyst-SNARE complexes by single particle cryo-EM. We will further explore the functions of the exocyst complex in SNARE-mediated membrane fusion via in vitro membrane fusion assay. These studies will not only identify new regulatory mechanism of the membrane fusion and clarify the coupling between vesicle tethering and membrane fusion in exocytosis, but also shed light to the mechanism of interactions between other cell organelles in the cell secretory and endocytic pathway.

细胞分泌和内吞途径中的细胞器互作主要由囊泡运输介导完成。囊泡运输包括囊泡生成、转运、锚定和膜融合四个步骤，其中锚定由MTC介导完成，膜融合由SNARE介导完成。目前，SNARE介导的膜融合机制已研究得较为清楚，而其调控机制和与囊泡锚定的偶联机制并不清楚。研究发现，外分泌中的MTC蛋白Exocyst复合体的亚基与SNARE蛋白相互作用，提示Exocyst复合体参与了SNARE介导的膜融合过程。为了阐明Exocyst复合体在膜融合中的作用及其机制，我们将检测Exocyst复合体与SNARE蛋白间的相互作用，并进一步使用单颗粒冷冻电镜解析其互作的分子机制。在此基础上，我们将使用体外膜融合技术研究Exocyst复合体在SNARE介导的膜融合过程中的功能及其机制。这些研究将不仅揭示外分泌过程中新的膜融合调控机制和囊泡锚定与膜融合的偶联机制，对于细胞分泌和内吞途径中其他细胞器互作机制也有重要提示意义。

细胞外分泌过程中，分泌囊泡与细胞膜的拴系和膜融合分别由Exocyst和SNARE蛋白介导完成。Exocyst是真核细胞中保守的八亚基复合体，除了介导囊泡拴系，其部分亚基能够与SNAREs互作并促进SNARE介导的膜融合。然而作为完整的功能复合体，Exocyst与SNARE偶联的机制仍不清楚。. 在本研究第一部分内容中，我们通过Dynabeads pulldown检测了Exocyst与SNARE蛋白的相互作用，发现Exocyst与SNARE三元复合体之间存在特异且较强的相互作用。接着我们表达了Exocyst复合体并组装了Sso2-Sec9-Snc2三元复合体，将两者孵育后通过分子排阻色谱进行纯化，发现少量SNARE三元复合体可能与Exocyst形成了新的复合体。对这部分样品进行冷冻电镜分析和三维重构，结果只含有Exocyst的结构，而没有SNARE的电子密度，提示两者的结合较弱。我们进一步通过交联质谱检测两者间的互作区域，发现Exocyst的头部能与SNARE四股螺旋束的两侧结合。这些实验结果显示，Exocyst与SNARE三元复合体之间存在特异性结合，且可能需要其他因子如能够提供锚点的细胞质膜来促进。. 在本研究第二部分内容中，我们分析了哺乳动物Exocyst的亚基Sec3与细胞膜互作的分子机制。与酵母Sec3定位于细胞膜并招募其他亚基不同，哺乳动物Sec3主要定位于细胞质中，与其他亚基一起由分泌囊泡运输到细胞膜，其在囊泡运输中的功能及机制并不清楚。我们构建了含小鼠Sec3 NTD (mSec3N)的嵌合Sec3酵母，发现其生长和外分泌与野生型一致，提示mSec3N功能与酵母Sec3 NTD相似。进一步检测mSec3N与PI4,5P2和Rho GTPase的相互作用，发现mSec3N能够以较低亲和力结合PI4,5P2，而不能够结合Rho GTPase。接着，我们解析了mSec3N的晶体结构，显示mSec3N虽然具有PH结构域，但与其他PH结构域明显不同，具有较短的β1-β2指状结构，这使得mSec3N结合PI4,5P2的口袋更小，且与Rho GTPase产生空间位阻。. 这些结果揭示了Exocyst与SNARE蛋白相互作用的特征，并揭示了哺乳动物Exocyst复合体与细胞膜互作的机制，为深入理解分泌囊泡与细胞膜的相互作用机制提供了新的见解。