萝卜硫素衍生物调节α-tubulin和微管相关蛋白Tau导致微管解聚诱发非小细胞肺癌凋亡

Sulforaphane (SFN) is the most potential natural anticancer component obtained from Crucifer. Its derivatives SFN-Cys and SFN-NAC play a role in inhibiting cancer in vivo, but the anticancer mechanisms of these derivatives are unknown. We previously found that SFN derivatives sustaining activated ERK1/2, downregulated α-tubulin and upregulated HSP70. It is reported that microtubule associated protein Tau bound to α-tubulin, maintained the dynamic balance of microtubule polymerization and depolymerization. We assumed that the SFN derivatives activated ERK1/2 and downregulated α-tubulin, also upregulated HSP70, promoted the phosphorylation of tau, resulting in changing the conformation of tau, and preventing the binding of Tau and α-tubulin, reducing microtubule stability, and causing microtubule depolymerization and cell apoptosis. In this proposal we will use Non-small cell lung cancer (NSCLC) cells and transplanted tumor model in nude mice, use immunocoprecipitation, immunofluorescence and microtubule polymerization, to investigate the molecular mechanism of tumor cell apoptosis induced by SFN derivatives. Two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry analysis will be used to find and validate the molecular signal network of SFN derivatives in NSCLC. This will provide theoretical basis for exploring safe and effective alternative drugs for targeted therapy of NSCLC, especially in paclitaxel-resistant NSCLC.

萝卜硫素（SFN）是从十字花科植物中提取的最有潜力抗癌成分，在体内以其衍生物半胱氨酸SFN和乙酰半胱氨酸SFN等发挥抗癌作用，但这些衍生物抗癌机制不详。我们前期发现：SFN衍生物持续活化ERK1/2，下调α微管蛋白，同时上调HSP70。已知微管稳定蛋白Tau结合α微管蛋白，保持微管聚合和解聚动态平衡。我们设想：若SFN衍生物活化ERK1/2，下调α微管蛋白，同时上调HSP70，促进Tau磷酸化，导致Tau构象改变，阻止其和α微管蛋白结合，降低微管稳定性，导致微管解聚和细胞凋亡。本课题拟用非小细胞肺癌细胞系和裸鼠移植瘤模型，结合免疫共沉淀、共聚焦显微镜、微管聚合实验等探索SFN衍生物诱导癌细胞凋亡的分子机理；同时将采用双向电泳、质谱分析寻找SFN衍生物调节微管动力学的分子网络，以确定更多潜在治疗靶点。此研究可为靶向治疗非小细胞肺癌，尤其对紫杉醇耐药型肺癌，找到安全、有效替代药物提供理论依据。

萝卜硫素（SFN）是从十字花科植物中提取的最有潜力抗癌成分，在体内以其衍生物半胱氨酸SFN和乙酰半胱氨酸SFN等发挥抗癌作用，但这些衍生物抗癌机制不详。本课题中，我们发现SFN活化ERK1/2，下调α-tubulin，同时上调Hsp70，上调微管相关蛋白Tau，降低微管稳定性，导致微管解聚，抑制人非小细胞肺癌（NSCLC）侵润并促进细胞凋亡。另外，在NSCLC细胞中，借助液相质谱及生物信息学分析，我们发现SFN上调176个靶蛋白，下调200个靶蛋白，在线粒体样本中，SFN上调10个靶蛋白并下调31个靶蛋白，初步揭示SFN的分子调控网络。借此我们进一步发现：SFN下调线粒体α-tubulin并解聚细胞质和线粒体内α/β-tubulin二聚体，瓦解由线粒体膜转位酶Tomm20、Timm23、Timm17A、Hsp70、LC3II和α-tubulin组成的跨线粒体膜复合物，阻断α-tubulin、果糖-2,6-二磷酸酶TIGAR和线粒体融合蛋白OPA1向线粒体的转运。同时，作为一种反馈，SFN上调Hsp70和微管相关蛋白LC3II的表达，促进Hsp70与α-tubulin和LC3II的结合。此外，SFN介导的ERK1/2磷酸化下调PINK1，并诱导线粒体定位的LC3II累积。结合Bafilomycin A1和CCCP发现，SFN降低溶酶体膜蛋白LAMP1与线粒体LC3II相互作用，阻断线粒体自噬体与溶酶体融合，导致自噬体累积，抑制线粒体自噬。此外，SFN下调LONP1，促进α-tubulin与LONP1的结合，激活Caspase-3，降解α-tubulin、OPA1、TIGAR、IDH3G和NDUFS3等与能量产生、线粒体形态、线粒体骨架相关的蛋白，导致细胞凋亡。组织芯片结果显示高表达TIGAR与NSCLC病理分级呈正相关。TIGAR敲除降低NADPH水平，增加活性氧并引起细胞凋亡。因此，在本课题中，我们揭示SFN抑制线粒体自噬并降低NADPH，破坏微管介导的蛋白质线粒体转运机制，进而破坏线粒体内蛋白修复，导致细胞凋亡，此机制为建立SFN高效抗癌的新疗法提供理论依据。同时，本课题还发现，SFN衍生物与紫杉醇联合用药，可促进紫杉醇耐药性NSCLC细胞凋亡，二者联用明显降低SFN衍生物和紫杉醇的用药剂量。此发现对SFN衍生物日后应用于临床的安全性具有重要的现实意义。