外源基因在银耳生物反应器中表达调控研究

Yeast-like conidia (YLCs) from the basidiomycete Tremella fuciformis Berk have the characteristics as a good expression host for heterologous gene. But the relatively low expression level of heterologous gene is a bottleneck problem which limits the application of YLCs as bioreactor. Therefore, in this project, on the basis of the constructed cDNA library of YLCs, the heterologous gene will be modified according to codon usage bias of high expression genes of T. fuciformis. The promoters and upstream sequences of high expression gene will be cloned based on the analysis of the expression abundance of function gene at growth phase of YLCs, and then be analyzed by bioinformatics software. At the same time, different expression regulation systems will be constructed by adding the noncoding sequence and stagnation signal peptide to the two ends of heterologous gene, and then be transformed into YLCs. The expression systems with different promoters from other resources will be used as the control. High expression systems will be confirmed by detecting the expression level of heterogenetic gene. Based on these results, the expression level of Survivin mutant will be further improved by controlling different sterin parhormone level and optimizing stage fermentation regulation. In this research, it is the first time that the regulation expression of heterologous gene in YLCs will be studied using the above strategies at DNA and transcription levels, which will have the important theoretical value and practical meaning for the high efficient expression of heterogenetic genes in T. fuciformis bioreactor.

银耳芽孢因其特殊性成为理想的外源基因表达宿主，但外源基因表达水平偏低是该表达系统的一个瓶颈问题。本研究在已建立银耳芽孢cDNA文库的基础上，首先根据银耳芽孢高表达基因密码子偏好性改造外源基因；其次根据银耳芽孢生长期功能基因表达丰度，克隆高表达基因启动子及其上游序列，利用软件分析并预测功能，通过添加非编码序列及滞留信号肽修饰外源基因，构建不同的表达调控系统，转化银耳芽孢，并与不同来源启动子表达系统比较，通过检测外源基因的表达量确定高表达调控系统，进一步采用不同固醇类激素水平及阶段式发酵调控优化高表达系统中Survivin突变体的表达量。本研究首次从DNA及转录水平上,利用上述策略调控外源基因在银耳芽孢中的表达，这对银耳作为新型生物反应器高效表达外源基因具有重要的理论意义和实际应用价值。

项目的背景：银耳芽孢因其特殊性成为理想的外源基因表达宿主，但外源基因表达水平偏低是该表达系统的一个瓶颈问题。.主要研究内容：获得银耳芽孢高表达基因及其密码子偏好性，克隆高表达基因启动子，优化目的基因密码子，构建不同的表达调控系统，转化银耳芽孢，并与不同来源启动子表达系统比较，通过检测外源基因的表达量确定高表达和适合的调控系统，进一步采用加入不同有机溶剂、抗生素、无机盐等调节细胞膜通透性，提高外源基因外分泌水平。.重要结果与关键数据：.1、.确定银耳芽孢高表达基因、密码子的偏好性及其启动子克隆.通过密码子在线分析软件CodonW 和CUSP 对测序获得的80 条蛋白编码序列进行分析，确定了银耳蛋白编码基因的18 个高频密码子，运用高表达优越密码子分析法确定19 个银耳高表达优越密码子。通过80条银耳CDS的密码子Nc值显示出银耳基因表达量存在较大的差异，获得G06高表达基因上游启动子片段。.2、9个不同真核表达载体的构建.成功构建了含有不同目的基因、不同启动子、添加信号肽以及目的基因密码子优化前后的9个不同真核表达载体。.3、表达载体转化银耳芽孢及表达分析.将毕赤酵母表达载体pPICZα A-Laccase、pAO815-lacZ和上述构建的9个银耳表达载体转化银耳芽孢，共获得43个转化子， 结果表明RP27启动子可以调控外源基因rfp在银耳芽孢中的正确表达，AOX启动子调控外源基因在银耳中的表达效率比RP27启动子高，密码子优化对外源基因在银耳芽孢中的表达有重要影响；在银耳芽孢中酵母表达载体比其它表达载体表达外源基因效率高。.4、不同处理对银耳芽孢细胞膜通透性的影响.通过添加不同物质调控银耳芽孢细胞膜通透性表明，二甲基亚砜、Tween 80、TritonX-100、两性霉素B和氯化钾均可在一定程度上提高细胞膜通透性，提高漆酶表达量及细胞内的漆酶分泌到细胞外，增强漆酶的代谢通量。.5、目前已发表SCI论文5篇，申请专利1项，培养研究生2名。.科学意义：针对银耳芽孢的特殊性，通过以上提高外源基因表达量的策略与优化途径，明确了影响外源基因在银耳芽孢中表达效率的因素，以银耳的最优密码子改造外源基因，建立相应的表达调控体系，提高外源基因在银耳生物反应器中的表达量，这对银耳作为新型生物反应器高效表达外源基因具有重要的理论意义和实际应用价值。.