双靶向多功能纳米基因传递载体在鼻咽癌生物治疗中的作用及机制研究

Nasopharyngeal carcinoma is endemic, which has the highest incidence rates in China. Currently, radiotherapy is the mainstay treatment, achieving a 5-year overall survival of about 50%. Based on our previous work, this project aims to design and construct a multifunctional double-targeting nano-carrier system for gene delivery. The system can efficiently target the nasopharyngeal carcinoma cell and deliver HSV-TK suicide gene into nucleus, followed by cancer cell-killing in direct and bystander effects. The Sendai virus F protein and co-stimulating B7-1 protein carried on the surface of the nano-carrier can strengthen anti-tumor immunological efficiency, and inhibit escape of cancer cell from immune system through activating CD4+T and CD8+T cells. And as a result, this will decrease the possibility of relapse and transfer of cancer cells. The double-targeting control, mediated by nasopharyngeal carcinoma cell-targeting peptide and special promoter for tumor, will have the following properties: more safety, lower toxicity, better quality of life. This study will be a fundamental stone for nasopharyngeal carcinoma biotherapy, and is meaningful and valuable in the future.

我国是全世界鼻咽癌发病率最高的国家之一，放疗是目前主要治疗手段五年生存率只有50%左右。本项目在前期工作基础上，设计和构建一种双靶向多功能纳米基因传递载体，能够高效靶向传递HSV-TK自杀基因进入鼻咽癌细胞核，通过直接和旁观效应特异性杀死肿瘤细胞；同时载体上嵌合仙台病毒F蛋白和共刺激分子B7-1蛋白，能够通过招引-活化效应激活CD4+T细胞和CD8+CTL，增强机体的抗肿瘤免疫效应，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，从而降低鼻咽癌复发及转移。鼻咽癌靶向肽和肿瘤特异启动子的双重靶向控制，使其具有更好的安全性，降低对机体的毒副作用，改善患者的生存质量。上述载体的构建和相应的机制研究将为探寻安全有效的治疗鼻咽癌生物治疗新方法提供依据和参考，具有重要的科学意义和潜在的实用价值。

随着近年来肿瘤发病率的不断提升，恶性肿瘤对人类构成了极大的威胁。鼻咽癌是原发于鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤，对大多数地区而言，鼻咽癌是一种发病率较低的肿瘤，然而却是我国常见的肿瘤之一。常用的癌症治疗手段在鼻咽癌晚期的治疗上收效并不高，鼻咽癌的基因治疗方法的建立可以为传统疗法提供必要的补充，具有重要意义。其中，有效的治疗基因、安全且体液条件下转染效率高的传递载体是有待解决的两个关键限制因素。本研究设计一种双靶向多功能纳米传递载体，用于鼻咽癌基因治疗。.采用叶酸为导向分子，将阳离子脂质体、PEI和NLS等提高转染的特殊功能相联合，制备靶向鼻咽癌的多功能基因传递载体。.首先，考察TRAIL基因对于鼻咽癌细胞的杀伤作用。通过对细胞表面TRAIL受体进行检测，细胞凋亡状态观察，MTT检测最终确定TRAIL可诱导人鼻咽癌CNE、HNE-1细胞的凋亡，达到杀伤癌细胞目的，可以作为鼻咽癌基因治疗的候选基因。.其次，将NLS以不同比例与PEI/DNA形成复合载体，细胞转染和细胞毒性实验结果表明，NLS在适当的优化比例下可显著提高非病毒载体的转染效率。.在此基础上，将脂质体加入PEI/DNA形成三元复合物，以期降低PEI的毒性。在脂质体中加入荷正电的磷脂和PEG磷脂，再与PEI/NLS/DNA复合，可制备得到粒径小于200nm、电位20mV左右的pCaLip/PEI/NLS/DNA复合物，该复合物具有较高的转染效率和良好的安全性，且在血清存在条件下其转染效率不受影响。.进一步，ELISA检测证明鼻咽癌CNE、HNE-1细胞表面高表达叶酸受体，为叶酸作为鼻咽癌基因传递载体的导向分子提供理论依据。制备荧光标记的叶酸修饰脂质体，荧光显微镜下观察到其对鼻咽癌细胞CNE具有靶向识别和入胞的功能。.制备叶酸修饰的fPEG-PEIlip/ DNA复合物，细胞转染实验结果表明，叶酸修饰可以显著提高复合物对鼻咽癌细胞的转染效率，而NLS的加入能够进一步提高转染效率。。.综上所述，本文成功的制备了一种双靶向多功能鼻咽癌基因传递载体，该载体安全性好、转染效率高，是一种具有应用潜力的鼻咽癌基因治疗载体。