TRPC6基因启动子区-254(C>G)SNP通过NF-κB调控足细胞功能的机制研究

Increased Ca2+ influx is the one of the major causation in the development of proteinuria. Moreover, TRPC6, as the only calcium channel protein in podocyte, involved in the major procedure of podocyte injury and repair. Gene mutations or abnormal expression of TRPC6 gene have been approved most associated with increased Ca2+ influx, however, the specific molecular mechanism remains unclear. Our previous study firstly demonstrated that in the promoter region -254(C>G) is an important SNP to regulate TRPC6 expression. Besides, the gene variant may create a binding site for NF-κB, however, the exact molecular mechanism remains to be made clear. Therefore, by the study of human podocyte cell line, apply the technology of EMSA, gene clone, gene transfection, and co-immunoprecipitation etc.,this research intended to: (1) Confirm the molecular mechanism of NF-κB regulating -254(C>G) in promoter region can alter the promoter activation of TRPC6. (2) Investigate the effection of TRPC6 associated Ca2+ signal pathway on the cytoarchitecture and function of podocyte. Accordingly, the research can specify the molecular mechanism of NF-κB regulating the podocyte function through -254(C>G) SNP in TRPC6 promoter, and provide new theoretical basis for the molecular mechanism of proteinuria.

细胞内钙离子内流增加是导致足细胞损伤并最终产生蛋白尿的主要原因之一。业已证明，作为足细胞表面唯一的钙离子通道蛋白，TRPC6基因突变或表达异常与细胞内钙离子内流增加密切相关，但其具体调控机制尚不清楚。我们前期研究首次发现TRPC6基因启动子区-254(C>G)是调控该基因表达的重要单核苷酸多态性(SNP)，而该变异位点可能与核转录因子NF-κB结合参与调控足细胞功能，但其确切分子机制有待阐明。因此本课题以人类足细胞株为研究对象，应用EMSA、基因克隆、基因转染和免疫共沉淀等技术：（1）明确-254(C>G)通过NF-κB 介导并调控TRPC6 基因启动子活性的分子机制；（2）进一步分析TRPC6钙离子通道及其相关的钙离子信号通路对足细胞结构和功能的影响，从而阐明-254(C>G)SNP通过NF-κB调控足细胞功能的可能机制，为蛋白尿发生的分子机制提供新的理论依据。

研究背景 肾病综合征是儿童常见的肾脏疾病之一，临床主要表现为蛋白尿，激素是其主要的治疗药物。但是，10-20%的肾病综合征患儿会发展为激素耐药。我们前期的研究发现激素耐药肾病综合征患儿肾组织TRPC6表达量较激素敏感患儿明显升高，病情基因检测提示大部分激素耐药患儿TRPC6基因携带-254C>G SNP，从而导致TRPC6表达升高，但是具体作用机制仍不清楚。.方法 构建包含TRPC6启动子区（含-254C 或者G）的双荧光素酶表达质粒并转染至人胚肾293细胞和人足细胞中，Luciferase检测2个细胞系中TRPC6启动子活性；Human TFBD 预测该启动子区突变前后转录因子结合情况，同时采用ChIP-PCR方法检测验证预测转录因子是否结合； 最后，使用肿瘤坏死因子-α刺激2个细胞系，再次采用Luciferase检测TRPC6启动子活性。.结果 在两个细胞系中，突变后TRPC6启动子活性均较突变前显著升高；Human TFBD 预测并通过ChIP-PCR验证了TRPC6突变后出现了 NF-κB 亚基 RELA的结合位点；同时，肿瘤坏死因子-α可使得突变后的TRPC6启动子活性较刺激前显著升高。.结论 -254C>G SNP 是TRPC6基因的功能性变异吗，可能作为中国肾病综合征儿童是否出现激素耐药早期且有效的预测手段。