Notch信号负调节因子在牙根发育启动中的作用研究

有关牙根再生和牙根发育机制的研究已逐渐成为牙齿再生研究领域的热点，然而目前牙根发育启动的分子机制并不清楚。已有研究证实，上皮性的Notch信号和间质中FGF10信号对于牙齿发育维持"牙冠模式"状态具有关键作用，但仍不清楚发育状态如何进入"牙根模式"。本课题前期研究新发现了一种Notch信号负调节因子（SEL1L）分别在"牙根模式"和"牙冠模式"发育中的表达具有显著性差异，因而推测其对牙根发育启动具有关键作用。为了明确其在牙根发育启动中的作用机制，本课题将采用SEL1L剪切体克隆、体外牙胚培养、慢病毒RNA干扰和过表达等技术，分别在器官、细胞、蛋白和核酸水平研究SEL1L对牙根启动的影响和作用机制，阐明其在Notch-TGFβ-FGF10信号系统中的窜扰(crosstalk)功能，为牙根发育启动机制和牙根再生研究提供实验依据和理论基础。

前期研究发现了Notch信号负调节因子在“牙根模式”和“牙冠模式”发育中的表达具有显著性差异，证明了其对牙根发育启动具有关键作用。在本课题资助下，为了明确Notch信号负调节因子在牙根发育启动中的作用机制，本课题设计并完成了以下课题研究：采用上皮细胞分离培养，免疫组织化学染色，基因过表达等技术，分别在器官、细胞、蛋白和核酸水平研究SEL1L对牙根启动的影响和作用机制进行了研究。进行了小鼠颈环细胞、上皮根鞘细胞和牙乳头细胞的分离培养，对细胞进行鉴定，同时构建抑制SEL1L表达的RNAi载体和SEL1L表达载体，并对转染效果和抑制效率进行鉴定。研究结果表明：1.成功建立了牙源性上皮的分离培养方法，使其可以满足实验要求。本方法已经申请国家发明专利（名称：改良组织块法培养啮齿类动物切牙颈环上皮细胞的方法，申请号：201210100046.1）；2.成功构建了针对Sel1L基因的RNA干扰载体和过表达载体，通过RT-PCR及Western Blot对转染前后的细胞进行对比检测，发现所构建的载体可以有效的抑制或者增强牙源上皮细胞中Sel1L基因的表达。2.SEL1L基因可能通过抑制NOTCH信号、促进TGFβ信号、抑制牙胚细胞增殖、促进牙胚细胞凋亡和分化而影响牙根发育；2.过Sel1L基因的RNA干扰载体成功转染体外培养的大鼠牙胚细胞，发现Sel1L基因阻断后细胞增殖活性增强，分裂相增加，证明Sel1L基因对细胞的增殖具有一定抑制作用，同时Sel1L基因阻断后细胞凋亡水平降低，说明Sel1L基因对细胞凋亡有一定的促进作用； RT-PCR及Real-time PCR方法检测发现牙胚细胞中Sel1L被阻断后，Notch信号的靶基因Hes1表达明显上调,证明在体外培养的牙胚细胞中，Sel1L可以有效的抑制Notch信号表达，进而影响细胞的分化和增殖；Western blot方法检测发现Sel1L基因被阻断后细胞中信号分子Smad4表达水平显著下降（与Sel1L的活性具有一致性），推测Sel1L可能参与了TGFβ信号通路而发挥作用,同时Sel1L基因被阻断后体外培养的牙胚细胞中DSPP蛋白表达没有显著性变化，因而推测Sel1L基因可能并不直接影响、调节DSPP的表达， Sel1L基因促进细胞分化的作用可能存在许多其它的代偿通路。本课题成果如下：1.研究共培养硕士研究生1名，并获得硕士学