植物花粉管导向的分子遗传研究

花粉管导向是植物授粉受精的关键环节，是雌、雄配子体相互作用的结果，直接关系到植物生殖效率和农作物产量。本申请在前期研究的基础上，以调控拟南芥花粉管导向的基因CENTRAL CELL GUIDANCE(CCG)为切入点，结合现代生命科学新技术手段，通过对CCG功能及其调控的基因网络的研究，了解CCG调控花粉管导向的分子机理，同时研究胚囊中央细胞对花粉管珠孔导向的作用机理。本申请还拟通过分子生物学和遗传学方法，分离更多花粉管定向生长异常的突变体，为最终克隆调控花粉管导向的基因，了解花粉管导向的遗传调控网络打下坚实基础。通过本项目的实施，将加深人类对植物花粉管导向这一自然现象的认识，并为农业生产和遗传育种中提高作物生殖效率提供新的思路和途径。

Central Cell Guidance (CCG)是一个在中央细胞中特异表达的核蛋白，在雌配子体控制花粉管珠孔导向过程中起到重要作用。CCG蛋白的N端具有Zinc finger结构域，可以与酵母RNA聚合酶复合体的TFIIB的N端Zinc finger功能互换，但CCG本身不能结合DNA。这些提示CCG可能作为转录调节因子起作用，通过调节下游基因的表达，从而控制花粉管珠孔导向过程(Chen et al., 2007, Plant Cell 19；3563-3577）。本项目通过筛选酵母双杂交文库获得了两个与CCG互作的蛋白CCG-Interacting Protein1 (CIP1)和CIP2。CIP1是一个功能未知的蛋白，而CIP2是已知的MYB类转录因子AGL80。前人试验证实AGL80与AGL61形成异源二聚体，结合目标基因启动子区的CArG box，调控基因表达。AGL61和AGL80都在胚囊中央细胞特异表达，是中央细胞成熟所需的。我们通过体外pull down等实验，证实CCG、CIP1、CIP2（AGL80) 和AGL61这四个蛋白能够发生互作，形成复合体。同时，CCG和RNA聚合酶复合体的TFIIF和TBP也可以互作，CIP1和RNA聚合酶的CTD结构域互作。这些结果说明CCG通过与CIP1, AGL80/AGL61异源二聚体和RNA聚合酶相互作用，介导转录因子AGL80/AGL61异源二聚体与RNA聚合酶复合体的作用，从而调节下游目标基因的转录表达。进一步通过Microarray分析，ChIP和实时定量PCR分析，发现在中央细胞中特异表达的六个富集半胱氨酸蛋白基因（CRP）中，有4个基因在ccg中比野生型中有明显下调的。受MYB98调节的23个DD（DOWNREGULATED IN DIF1）类的基因中，有18个基因下调5倍以上，有4个基因下调3倍左右，仅有一个基因表达基本不变。同时拟南芥胚囊信号分子AtLURE也受到下调。这些结果说明CCG一方面直接调节中央细胞中信号分子的表达，同时也通过助细胞间接调节胚囊信号的表达。以上结果揭示了CCG作用的分子机制，明确了CCG基因在花粉管导向过程中的关键作用，加深了我们对花粉管导向这一被子植物保守机制的认识。