TLR-MyD88/TRIF通路对CpG ODN诱导中华绒螯蟹免疫耐受的调控机制研究

CpG ODN is an efficient kind of immune modulator, which is capable of enhancing immunity, has been recently highly focused in life sciences, it also has been used as a potential immunostimulant in crustacean aquaculture. In our previous research, it was observed that sustained CpG ODN stimulation could induce immunological tolerance in Chinese mitten crab, Toll-like receptor pathway might play an important role in the immune tolerogenic response. It is urgent and significant to investigate the role of CpG ODN in the induction of immune activation as well as immunological tolerance. The present research will be performed by biochemistry, cell biology, molecular biology, molecular immunology and bioinformatics approaches, aiming to describe immunological tolerance response induced by CpG ODN, to reveal the expression pattern of TLR-MyD88/TRIF pathway genes involving in the immunological tolerance in mRNA and protein level, and finally to preliminarily explore the modulation mechanism of CpG ODN in the induction of immunological tolerance regulated by TLR-MyD88/TRIF pathway in Chinese mitten crab in vivo and in vitro. The achievements of this project will increase the knowledge of the innate immune system regulation in Chinese mitten crab, enrich the research of crustacean immunity, provide new sights on disease prevention and control in aquaculture and contribute to the healthy development of aquaculture in China.

CpG寡聚核苷酸（CpG ODN）能够显著增强机体免疫力，其作为免疫调节剂在生命科学研究领域受到广泛关注，并已应用于甲壳动物养殖业。申请人在前期研究中发现持续CpG ODN刺激会诱导中华绒螯蟹免疫耐受的发生，而Toll样受体通路可能在此过程中发挥重要的调节作用，深入了解CpG ODN诱导免疫激活和免疫耐受的作用机制意义重大。本研究拟综合运用各种现代生物学技术手段，以CpG ODN诱导中华绒螯蟹免疫耐受为切入点，探明免疫耐受效应的基本特征，从转录和翻译水平鉴定中华绒螯蟹TLR通路在CpG ODN诱导免疫耐受发生过程中的响应模式，并从个体水平和细胞水平进一步探究并阐明TLR-MyD88/TRIF通路对CpG ODN诱导中华绒螯蟹免疫耐受的信号调控机制。研究成果将深化对中华绒螯蟹固有免疫系统调控机制的认知，丰富和发展甲壳动物免疫学内容，并为推动我国水产养殖业健康发展提供新思路和新方法。

CpG寡聚核苷酸（CpG ODN）作为免疫调节剂在生命科学研究领域受到广泛关注，并已应用于包括甲壳动物在内的水产养殖业。近年来，在高等生物中的研究表明CpG ODN也会诱发机体免疫耐受，而在低等动物中尚未见相关报道。申请人在前期研究中发现持续CpG ODN刺激会诱导中华绒螯蟹免疫耐受的发生，Toll样受体通路可能在此过程中发挥重要的调节作用。基于此，本项目首先探究了不同剂量CpG ODN对中华绒螯蟹生长及免疫能力的影响。结果显示，持续投喂CpG ODN能显著降低中华绒螯蟹的增重率和蜕壳率及小肠微绒毛数量和分支及柱状上皮细胞和杯状细胞数量，而间接投喂CpG ODN则上述指标有不同程度的促进作用。此外，还发现低剂量注射CpG ODN将提高中华绒螯蟹血淋巴细胞的吞噬率及EsERK、EsJNK、EsDorsal在血淋巴细胞中的磷酸化水平，而高剂量注射则抑制上述指标。高剂量CpG ODN处理后，TNF-α含量和抗菌肽（EsALF1、EsALF2和EsALF3）的表达量均显著降低。这些结果说明CpG ODN持续刺激能够引起中华绒螯蟹的免疫耐受效应。进一步，本研究分析了TLR通路对CpG ODN刺激的响应特征，结果显示，在CI和CC组，EsTLR1和EsTLR2的表达量均呈现先上升后下降的趋势，但EsTLR2的表达量变化更为明显，推测EsTLR2可能在过程中发挥主要作用。针对上述结果，本项目锚定TLR信号通路重要负调节因子β-抑制蛋白1（β-arrestin1），解析其对高剂量CpG ODN诱导的免疫耐受的调控机制。结果表明，在高剂量CpG ODN注射后，血淋巴细胞中Esβarr1的表达量显著上升，且其在血淋巴细胞的细胞质中的分布也显著升高；利用RNAi技术敲降Esβarr1的表达后，高剂量CpG ODN抑制的EsALF1、EsALF2和EsALF3的表达量和Dorsal的磷酸化水平均显著高于对照组。综上，本项目初步揭示了高剂量CpG ODN可以诱导中华绒螯产生免疫耐受现象，Esβarr1作为TLR信号通路的负调节因子可以通过降低Dorsal的磷酸化水平来减弱高剂量CpG ODNs对抗菌肽分泌的抑制作用。研究成果将有助于深化对甲壳动物固有免疫系统调控机制的认知，也对CpG ODN如何应用于中华绒螯蟹养殖产业提供重要的理论支撑。