野生大豆类受体蛋白激酶GsSRK调控耐盐碱性的分子机理

Salt-alkaline soil severely affects crop yield and quality, and has become one of the most important problems that restrict the agricultural production in China. Hence, it is of great importance to study the molecular mechanism in response to salt-alkaline stress, and to improve the salt-alkaline tolerance of crops through crop breeding by molecular design. In previous studies, we have characterized a Glycine soja receptor like protein kinase, GsSRK, which positively regulates plant salt-alkaline tolerance. However, up to now, the precise molecular basis of GsSRK in response to salt-alkaline stress is still unknown. For this reason, in this project, we will identify the plasma membrane localization, the kinase catalytic activity, the CAM binding affinity and CAM binding sites of GsSRK, the regulation of GsSRK kinase activity by Ca2+/CAM binding, as well as the biological function of GsCAMs in salt-alkaline stress responses. We try to understand how GsSRK recognize and bind Ca2+/CAM, activate itself and control plant tolerance to salt-alkaline stress. Collectively, our results will be of great benefit to elucidate the signal transduction and regulatory network in salt-alkaline responses, and provide theoretical support for molecular breeding of legume crop with superior salt-alkaline tolerance.

土壤盐碱化严重影响作物产量和品质，是我国农业生产面临的重大问题。因此，深度解析作物耐盐碱分子机制，利用分子设计育种提高作物耐盐碱性具有重要的研究价值。我们前期从野生大豆中鉴定了功能显著的耐盐碱蛋白激酶GsSRK，但目前尚未明确其调控耐盐碱性的具体作用机理。因此，为探索GsSRK耐盐碱分子机制，本项目设计了6个不同层次的研究，依次揭示GsSRK蛋白质膜定位、激酶磷酸化活性、CAM结合活性和特异性、CAM结合位点、Ca2+/CAM对GsSRK激酶活性的调控作用、以及GsCAMs基因的耐盐碱功能，最终阐明GsSRK如何通过识别Ca2+/CAM调节自身活性，调控植物耐盐碱性的。研究结果在理论上，将进一步完善植物耐盐碱分子调控网络，在应用上将为通过分子设计育种提高作物耐盐碱性提供理论指导，具有重要的理论研究价值和应用价值。

渗透胁迫严重影响大豆产量和品质。我们前期发现GsSRK蛋白激酶参与大豆盐胁迫应答，但尚未明确GsSRK调控大豆耐盐性的具体作用机理。本项目以前期盐胁迫应答GsSRK为切入点，分析了其在渗透胁迫下的表达模式，发现GsSRK不仅耐盐，还具有抗旱的功能。构建了GsSRK超量表达转基因株系，发现GsSRK具有抗旱性，且通过ABA途径影响抗旱性。通过原生质体瞬时表达体系和植物体内稳定表达体系共同验证了GsSRK蛋白激酶是定位于细胞质膜。通过磷酸化丝氨酸抗体和32P同位素的方法检测体外蛋白磷酸化信号时发现，GsSRK具有自身磷酸化活性，并且不需要Ca2+的协助。基于GsSRK蛋白激酶有CAMBD结合位点，通过家族分析，筛选出4个（GsCAM1/3/4/5）钙调素蛋白用于验证与GsSRK的相互作用关系，采用Y2H和BiFc验证了GsSRK与GsCAMs存在相互作用关系，BiFC和 Pull Down验证了与GsCAMs互作位点。利用原生质体瞬时表达体系和植物体内稳定表达体系共同验证了GsCAMs蛋白是定位于细胞质膜，细胞核和细胞质，进一步确定了GsSRK与GsCAMs相互作用的位置在细胞质膜。应用qRT-PCR分析发现GsCAM1/3/4/5在渗透胁迫下的表达模式，发现GsCAM4和GsCAM5基因表达在渗透处理后显著上调。通过检测GsSRK基因启动子GUS信号，发现GsSRK具有时空表达特异性，胁迫应答关键调控区域在-284～-127（Pro5）。通过检测GsCAM4/5基因启动子GUS信号，发现GsCAM4/5基因表达的确受渗透胁迫诱导。综上所述，本研究表明GsCAMs在细胞质膜上传递信号来调控GsSRK蛋白激酶的耐逆性，为阐明大豆耐逆分子调控网络提供了重要参考，为大豆耐性分子育种提供了理论依据和基因资源。