拟南芥PPR蛋白PDM1调控叶绿体基因rpoA前体mRNA多顺反子切割的机理

PPR蛋白对质体基因表达调控的研究是当前植物分子生物学研究的一个热点。PDM1(AT4G18520)为模式植物拟南芥PPR家族PLS亚家族成员，调控质体基因组编码的RNA聚合酶（PEP）亚基rpoA的多顺反子切割。本项目我们将深入研究PDM1调控质体基因多顺反子切割的机理。具体研究内容主要包括：1）利用PDM1-FLAG融合基因成功互补pdm1突变体的转基因植株，以及RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation） 技术验证PDM1在rpoA所在多顺反子上的结合，并进一步分析PDM1特定的结合位点；2）利用FLAG标签抗体分离与PDM1结合的蛋白复合物，通过测序鉴定与PDM1共同参与rpoA转录后切割的蛋白因子，并利用酵母双杂交等技术进行相互作用验证。该项目的完成将促进我们关于PPR蛋白对质体基因表达调控分子机制的深入了解。

PPR(Pentratricopepite repeat)蛋白家族是植物中发现的最大蛋白家族之一，在叶绿体和线粒体基因表达过程中起重要作用。PDM1(AT4G18520)为模式植物拟南芥PPR家族PLS 亚家族成员，本项目研究发现PDM1蛋白广泛参与调控叶绿体RNA代谢的多个过程。拟南芥pdm1突变体呈白化致死表型，叶绿体发育存在严重缺陷，rpoA单顺反子转录本缺失。通过RNA免疫共沉淀技术分析表明PDM1结合在S11-rpoA的基因间隔区。Western分析显示在pdm1突变体中rpoA蛋白的积累量仅为野生型的1/3。rpoA为质体编码的RNA聚合酶（PEP）的核心亚基，在pdm1中， PEP依赖的质体基因的表达下降，显示PEP活性受到影响，从而导致叶绿体发育受阻。利用蛋白免疫共沉淀技术获得了126个与PDM1免疫共沉淀蛋白，其中包括参与RNA加工的CP29A,CP31A；广泛参与RNA编辑的因子MORF9；以及预测参与内含子剪接作用的CRS1-R。酵母双杂交实验证明PDM1与MORF9及CRS1-R存在直接蛋白相互作用。PDM1同时参与叶绿体基因ndhA和trnK内含子的剪接。本项目完成了PDM1调控叶绿体基因转录后加工的分子机制的研究，加深了我们对PPR蛋白调控叶绿体基因表达的深入理解。