外源性细胞转录因子诱导在体神经胶质细胞再编程促进大鼠局灶脑缺血的神经修复

Recently, neural stem cell transplantation and the cell reprogramming have been introduced for pre-clinical research of neurological repair. We reprogrammed primary mouse astrocytes via ectopic retroviral expression of Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc, and found that the induced pluripotent stem cells (iPSCs) from mouse astrocytes expressed stem cell markers in vitro. Here,reprogramming of rat middle cerebral artery occlusion cortical and hippocampal CA1 astrocytes with those four transcription factors to generate the iPSCs will be observed in vivo. Meanwhile, we will reprogram primary cortical and hippocampal CA1 astrocytes, which undergo oxygen and glucose deprivation in vitro, via ectopic retroviral expression of those four factors. The ability of those iPSCs to differentiate into neuronal stem cells and the neuronal markers of differentiated cells will be checked by western blot, real-time PCR and immunocytochemistry etc. Furthermore, the mechanisms of the migration, differentiation of those iPSCs will be detected in our models. Together, we will evaluate the theoretical value and the application of astrocytes induced iPSCs through behavior study and other technologies in this study.

近年来，神经干细胞移植和细胞再编程技术为神经修复提供了新的希望。我们前期的体外研究结果表明，通过表达外源性的细胞转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4 和c-Myc)，可以将成年小鼠的星形胶质细胞，诱导成为具有神经干细胞活性的诱导多能干细胞（iPSCs)。本课题主要借助于SD大鼠大脑中动脉缺血模型和原代神经细胞培养，并运用立体定位注射技术、免疫组织化学技术、实时定量PCR技术等，探讨在星形胶质细胞上表达逆转录病毒携带的外源性细胞转录因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和 c-Myc），能否诱导它们转变成具有干细胞活性的诱导多能干细胞。同时，我们将检测脑局部发生损伤或缺血后，诱导多能干细胞在病变部位迁移、分化，并在功能上替代已丢失的神经元，以继续执行损伤脑区神经功能的主要分子机制。进一步利用组织形态学和行为学手段，评估星形胶质细胞诱导成神经干细胞的理论和实践应用价值。

经过本课题三年的实施，我们通过将小鼠星形胶质细胞再编程为诱导性神经前体细胞（AsiNPCs），探讨其促进大鼠局灶脑缺血后的神经修复作用的研究。首先，我们用表达外源性细胞转录因子的逆转录病毒，将小鼠星形胶质细胞直接转分化为诱导性神经前体细胞，其不仅表达正常神经干细胞特异性的标志分子，还具有原代神经干细胞的特性。星形胶质细胞来源的诱导性神经前体细胞（AsiNPCs）具有和正常神经干细胞相似的多潜能性，在特定的分化条件下可以分化为神经元和星形胶质细胞，未见明显少突胶质细胞存在。同时，我们将AsiNPCs通过脑立体定位技术移植到大鼠局灶脑缺血模型缺血区，利用免疫荧光技术观察AsiNPCs在缺血区域的存活、增殖、迁移及分化的情况，结果表明，AsiNPCs可在缺血区持续存活及增殖，且可以分化为神经元，部分替代缺血区丢失的神经元。我们运用不同的行为学手段评估显示,星形胶质细胞来源的诱导性神经前体细胞能促进脑缺血后的神经修复。目前的研究成果为脑缺血的干细胞治疗提供了新的希望。