miR-99a在儿童AML中的表达和功能研究

近年研究表明, miRNA与白血病发生发展及预后密切相关，但仅部分白血病相关miRNA被鉴定，其作用及机制也远没被阐明。我们前期对99例小儿白血病研究发现，MiR-99a在小儿AML中表达明显增高,平均为正常对照的9.2倍。计算机分析其预测靶基因有41个，其中与白血病细胞分化和凋亡相关的有5个。推测 miR-99a可能通过沉默其靶基因,在AML发病中起类似"癌基因"作用。本项目拟通过体内（研究 miR-99a与小儿AML分型、临床表现、诊治及预后关系）和体外实验（在AML细胞株或小儿AML白血病细胞中上调或下调其表达，检测细胞增殖、凋亡情况及对分化影响，阐明miR-99a在小儿AML发病中作用。并通过分析与预测靶基因的相关性，阐明miR-99a的作用机制。该项目完成不仅对揭示白血病中"RNA调控网络"具有重要意义，而且为白血病诊治及预后分析提供新的理论依据，为白血病治疗提供新的靶标。

近年研究表明，miRNA与白血病的发生、发展及预后密切相关，但仅部分白血病相关miRNA被鉴定，其作用和机制也远没被阐明。我们前期对99例小儿白血病骨髓标本用基因芯片分析miRNA的表达谱，发现miR-99a在小儿急性髓细胞白血病（AML）中表达明显增高，平均为正常对照的9.2倍，但其在儿童髓系白血病中的作用及调控机制未明。为此，本研究首先用PCR验证基因芯片的结果，证实miR-99a在所有AML（M1-5）（n=23）和慢性粒细胞白血病（CML）（n=4）初诊患者骨髓样本中高表达，而在91%的AML（n=23）和所有CML（n=4）缓解患者骨髓中呈低表达（p<0.05），其水平降至与正常对照组相似；通过lipo2000瞬时转染，miR-99a高表达促进髓系白血病细胞株HL60和K562细胞增殖（MTT实验），抑制凋亡（双染凋亡实验）；生物学信息方法[TARGETSCAN（http:// www. targetscan.org/），PICTAR（pictar.mdc-berlin.de/）生物学软件]预测miR-99a可能调控的靶基因，共有41个，通过文献检索，发现与白血病细胞分化和凋亡相关的有5个：TRIB2、CTDSPL、Hoxal、RAC-1、MCL-1；在293T细胞，通过双荧光报告Lipo转染实验，初步验证在上述5个预测的基因中抑癌基因CTDSPL和TRIB2是miR-99a靶基因，进一步在K562细胞，采用电转染双荧光报告实验再次验证CTDSPL和TRIB2是miR-99a的靶基因；Western blot分析显示，在HL60和K562细胞，通过转染使miR-99a高表达可抑制CTDSPL和TRIB2的表达，而在AML患者骨髓细胞，87%和74%的初诊患者CTDSPL和TRIB2低表达，58%和69%的缓解患者CTDSPL和TRIB2高表达，说明大多数患者CTDSPL和TRIB2的表达受miR-99a调控。本研究首次显示，miR-99a在儿童AML和CML中异常高表达，起原癌基因的作用，机制之一是下调其靶基因CTDSPL和TRIB2（抑癌基因）而发挥作用；提示AML和CML这两种不同的髓系白血病可能在疾病的发生和发展过程中存在一些共通的生物学机制，值得进一步研究；miR-99a可能是一个有前途的治疗儿童髓系白血病的靶标。