杨梅花色苷抑制重金属损伤睾丸间质细胞的机制研究

In rencent years, much attention has been paid on heavy metal-induced human reproductive toxicity and it is revealed that heavy metal could induce male reproductive toxicity through oxidative damage pathway in our previews study. So based on the idea of "functional factor with high antioxidative activity in food could inhibit effects of heavy metals-induced male reproductive toxicity", we designed this study to intervene Leydig cells damaged by Cd, Hg and Pb using Cy-3-Glu to clarify the inhibitory approach of anhthocyains to damaged Leydig cells induced by heavy metals though observing the change of cell morphology and function with Flow Cytometry and confocal microscope,the change of mRNA and express of the key enzyme in mitochondria antioxidation system and formation process of testosterone with real-time fluorescence quantitative RT-PCR and Western blot method. Besides, the change of free radical concentration and heavy metal chelate ratio in cells were also investigated using the fluorescent probe 2′,7′-dichlorofluorescin-diacetate and Rose-Drago method respectively, and the results will be combined with inhibit pathway to explore the inhibitory mechanism of anthocyanins. This research is very important for the application of anthcyanins in protecting human from heavy metals induced reproductive toxicity and has significant theory and practical value.

重金属对人类的生殖健康造成的威胁日益引起人们重视，前期研究发现重金属可通过氧化损伤途径导致雄性生殖毒性，因此本研究拟"以抗氧化性强的食源性功能因子实现对重金属暴露的雄性生殖毒性的抑制"这一新思路，以矢车菊-3-葡萄糖苷（Cy-3-Glu）为模式化合物，以镉、汞、铅等重金属损伤的雄性睾丸间质（Leydig）细胞为模型，采用流式细胞仪和共聚焦显微镜等手段观察花色苷干预后细胞形态和功能的变化，采用实时荧光RT-PCR、蛋白印迹等技术分析花色苷干预后细胞的线粒体抗氧化系统和睾酮生成途径关键酶在mRNA及蛋白水平表达的变化，阐明花色苷对重金属暴露的Leydig细胞损伤的抑制途径。采用2', 7'-二氯荧光黄双乙酸盐探针和 Rose-Drago 方法分别测定细胞中自由基变化和重金属螯合率，结合抑制途径探讨花色苷的抑制机理。本研究对于利用花色苷预防重金属对人体生殖毒性危害具有重要的理论价值和现实意义。

重金属蓄积引起的生殖毒性一直是研究的热点，氧化损伤是重金属对雄性生殖毒性损伤机理的主要学说，C3G在体内抗氧化的机制（清除自由基）与重金属引起雄性生殖毒性的可能机制(产生自由基)相呼应。本实验研究了C3G对重金属Cd和Pb引起的生殖毒性的干预效果以及具体机制。.本课题提出两个设想：（1）利用体内实验初步判断C3G对重金属引起的生殖毒性的干预作用；（2）利用细胞实验具体研究C3G对重金属暴露的睾丸间质细胞损伤的抑制机制研究。.基于上述学术思想，本课题开展了以下研究：.（1）以雄性SD大鼠为研究对象，设定铅(0.5mg/kg)染毒组、C3G高、低剂量保护组和正常对照组四个处理组，通过对生殖器官睾丸组织的病理形态观察，睾酮合成量以及cAMP的变化，初步判断C3G对重金属引起的生殖损伤的干预作用。结果表明，C3G可以改善镉、铅造成的大鼠睾丸损伤，表现为激素水平的明显变化以及染毒SD大鼠形态结构的明显好转。 .（2）体外实验，首先采用MTT法筛选Cd、Pb及C3G的作用浓度，化学发光法（chemiluminescence，CL）检测细胞内活性氧（reactie oxygen species，ROS），流式细胞仪（flow cytometry, FCM ）检测R2C细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）变化情况；Western blotting 法检测StAR 、SOD2蛋白表达量。放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）检测R2C细胞孕酮的合成和分泌情况来探索重金属暴露的R2C细胞的功能损伤是否有抑制作用?.实验结果表明，C3G能够显著降低重金属对细胞活性的损伤；C3G对于Cd引起的R2C细胞ROS变化、MMP损伤水平变化均能起到一定的保护干预作用；C3G可以上调由Cd引起的关键蛋白StAR的表达量，下调抗氧化关键酶S0D2的表达；C3G可以对Cd和Pb引起的孕酮合成能力下降进行干预。由此推测C3G可能通过降低R2C细胞中ROS水平来抑制细胞内MMP下降，从而促进将胆固醇从线粒体膜外向膜内转运，并提高Cd暴露的R2C细胞孕酮合成通路中的关键调节蛋白StAR的表达进而促进孕酮合成。