棉铃虫自然种群氨肽酶N基因突变与对Bt毒素抗性的关系

随着Bt 棉的大面积种植，棉铃虫自然种群对Bt 棉的抗性进化问题显得非常重要。我们对室内筛选获得的棉铃虫对Bt 毒素Cry1Ac 高抗品系的研究表明，氨肽酶N基因的突变导致其表达产物不能与Cry1Ac 结合，从而对Cry1Ac 产生抗性。但在棉铃虫自然种群中，氨肽酶N基因是否存在类似基因突变，且这些突变基因与Cry1Ac毒素分子互作关系如何？与Cry1Ac毒素抗性有何种关系？这些不定因素对明确自然种群抗性分子机制及开展抗性基因频率检测增加了难度。本项目采用F1/F2单雌家系和诊断剂量相结合的方法，拟从棉铃虫自然种群中筛选出抗性个体，并通过基因克隆与序列比对，找出氨肽酶N基因突变类型，应用 ligand blotting手段分析其与Cry1Ac毒素的互作，明确突变与抗性的关系。该研究对阐明棉铃虫自然种群对Bt抗性分子机制，开展抗性基因频率监测及棉铃虫对Bt棉抗性预警和治理具有十分重要的意义。

在2011~2013年期间，采用F1/F2抗性检测方法，在山东夏津和河北安次棉区分别共测定了1912和1234对单雌家系，保守的估计了夏津和安次棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性基因频率均还处于较低水平（<0.0001），F1代幼虫在Cry1Ac饲料上的相对平均发育级别数值表面，田间棉铃虫种群对Bt-Cry1Ac耐性这几年并没有发生明显的变化。不同寄主来源的田间棉铃虫种群敏感性差异测定发现，Bt棉花上采集的棉铃虫种群，与小麦，玉米等多个非Bt作物寄主上的种群相比，耐药性明显较高。对田间检测到的耐性家系，室内进一步筛选且成功保存下来的抗性品系，成功克隆到氨肽酶N1全长基因，且与敏感品系相比，发现APN1蛋白结合区域发生缺失突变，结合区缺失后为204bp，且体外蛋白杂交进一步证明该突变与抗性有直接的关系。对田间1820棉铃虫个体DNA分子检测发现，没有检测到APN1相关抗性突变基因。该项目成功建立了针对APN1特异突变DNA分子检测技术，为大范围开展田间种群抗性检测奠定了必要基础。