ANRIL对牙龈卟啉单胞菌感染牙周膜干细胞调控细胞周期作用的研究

Periodontitis is a chronic inflammatory disease of the periodontal support tissues. Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) is one of the important pathogens for perodontitis. The periodontal ligament stem cells played an important role in restoration of periodontal tissue damage and in the replacement of periodontal tissue in normal. It will be of great importance in exploring cell growth or death mechanism on periodontal ligament stem cells with P. gingivalis. Our early work showed that the periodontal ligament stem cells stimulated with P.gingivalis induced an inhibition of cell cycle in G1 phase with p16INK4a increased. Studies have shown that ANRIL is transcription antisense product of p15INK4b gene, which takes part in gene silence of p16INK4a.The periodontal ligament stem cells stimulated with P. gingivalis were arrested through intervening INK4b-ARF-INK4a gene expression by long chain noncoding RNA – ANRIL. We expect to find a path to alter cell cycle of periodontal ligament stem cells stimulated with P.gingivalis, in order to promote periodontal tissue repair and regeneration after periodontal infection.

牙周炎是牙周支持组织的慢性炎症性疾病。菌斑细菌及其产物是牙周病的主要病因，其中牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）是证据充分的致病菌。牙周膜干细胞在维持正常的牙周组织更新和牙周炎组织损伤修复中起到了重要的作用，因此，探索P.gingivalis对人类牙周膜干细胞生长或死亡的影响机制，对防治牙周炎具有重要意义。本课题组前期研究发现P.gingivalis感染牙周膜干细胞后，细胞周期在G1期发生阻滞，同时p16INK4amRNA和蛋白表达上调。研究表明ANRIL是p15INK4b基因的反义转录物，参与p16INK4a基因的沉默。因此，我们推测P.gingivalis感染牙周膜干细胞，长链非编码RNA-ANRIL通过干预INK4b-ARF-INK4a基因座的表达调控细胞周期阻滞，期望发现一种途径阻断P.gingivalis感染牙周膜干细胞引起细胞周期改变，促进牙周组织损伤修复和再生的可能。

牙周炎是世界范围内患病率较高的口腔疾病之一，牙龈卟啉单胞菌的定植与牙周组织病变的严重程度和复发密切相关，是重要的牙周致病菌之一，牙周膜干细胞在维持正常的牙周组织更新和牙周炎组织损伤修复中发挥了重要的作用。本课题围绕ANRIL在P. gingivalis感染牙周膜干细胞对细胞周期影响展开研究。课题组原代培养牙周膜细胞，通过有限稀释法分离和纯化牙周膜干细胞并进行生物学鉴定，通过成骨和成脂诱导证实牙周膜干细胞的多项分化能力。P. gingivalis 感染牙周膜干细胞24h后诱导细胞凋亡并引起细胞G1期停滞，caspase3/9蛋白活性升高，Cyclin D/E基因和蛋白表达降低，p15INK4b、p16INK4a和p14ARF基因和蛋白表达升高；P. gingivalis感染牙周膜干细胞后ANRIL 基因表达下降，并且有浓度依赖性，感染复数越大，ANRIL基因表达降低越显著，表明ANRIL参与对细胞凋亡和细胞周期进程的调控。基因沉默ANRIL，P. gingivalis感染牙周膜干细胞能够加剧细胞凋亡和G1期细胞周期的停滞，caspase3/9蛋白活性和p15INK4b、p16INK4a和p14ARF基因和蛋白表达进一步升高，Cyclin D/E基因和蛋白表达下降显著，与对照组、单纯感染组和沉默组相比，差异均具有统计学意义。利用高通量测序检测分析P. gingivalis感染牙周膜干细胞的基因变化，4131个差异表达基因，1409个差异表达基因上调，2722个差异表达基因下调，差异基因富集通路主要集中在牙周膜干细胞生物学行为方面例如细胞自噬、应激和免疫调节信号通路方面，表明P. gingivalis感染牙周膜干细胞能够引起多种细胞功能的改变，在牙周膜干细胞的干性维持、多向分化和增殖中有重要作用。希望通过我们的研究发现P. gingivalis感染牙周膜干细胞导致细胞周期停滞新的分子调控机制，找到合适的靶点，阻断感染引起的牙周膜干细胞凋亡和周期停滞，为牙周病的防治提供理论依据，促进牙周组织的修复和再生。