TLR3通路功能性基因多态与乳腺癌遗传易感性及预后的关联分析及功能论证

乳腺癌严重危害女性健康，位居城市女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌属多基因遗传性肿瘤，除BRCA1/2等高外显率基因突变外，低外显率基因的联合作用在其发病机制中占据重要地位。当前有限的报道及课题组前期工作显示TLR3通路参与了乳腺癌的发生发展；而TLR3通路关键基因的多态性与乳腺癌遗传易感性及预后的关联研究还是一个相对空白的领域。课题组拟针对TLR3通路相关性多态开展关联研究，运用现代分子流行病学、分子生物学技术，筛选并验证与乳腺发生/发展相关的多态位点。课题组将（1）完成两期独立的病例对照研究（总例数约4000例），筛选TLR3通路乳腺癌易感多态，（2）分析TLR3功能多态与乳腺癌预后的关联，（3）功能性论证风险多态致癌或促癌的分子机制。本研究成果将揭示TLR3通路多态性与乳腺癌发生发展不同阶段的内在联系，为最终构建乳腺癌风险预测模型进行早期干预、开展预后评估进行个体化诊治提供临床前证据。

Toll样受体家族是近年新发现一类信号通路基因，控制着由天然免疫向获得性免疫的转变。最近的研究显示，不仅外源性分子，许多内源性分子也能经TLRs信号传导途径激活免疫应答。其家族成员之一，Toll样受体3（TLR3）所介导的通路中有两个关键基因核转录因子kappaB（NF-kappaB）和B细胞编码k轻链多肽基因抑制激酶E（IKBKE）被证实与乳腺癌的进展密切相关，但对于该通路关键基因TLR3和IKBKE在乳腺癌发生中的研究尚处于空白。我们选取TLR3所介导的通路中的三个关键基因TLR3、IKBKE和Toll样受体接头分子1（TICAM1）作为乳腺癌易感候选基因，并选取三个基因中的17个SNP位点进行分型及关联分析。首先，我们通过一期病例对照研究（n=2, 303例）发现三个TLR3基因多态rs5743305、rs5743312、rs3775296与散发性乳腺癌显著相关。其中TLR3启动子区域SNP rs5743305的-926bpA等位基因能显著增加乳腺癌发生风险，OR为1.220（95% CI为1.059- 1.407, P=0.007）；rs5743312的T等位基因型能显著增加乳腺癌的发生风险，OR为1.173（95% CI为1.046-1.315，P=0.006），rs3775296的+95T等位基因型能显著增加乳腺癌的发生风险，OR为1.159（95% CI为1.036-1.298，P=0.011）。在第二期以家族性/早发性人群为主的病例对照研究中得到了进一步验证（n=1, 248）。两期研究（n=3, 551）的联合P值分别是1.97×10-4（rs5743305）、7.01×10-5（rs5743312）和8.69×10-5（rs3775296）。进而我们研究了位于该基因启动子-926bp区域具有潜在功能意义的位点—rs5743305的作用机制。通过瞬时转录和荧光活性检测，我们在不同的细胞系里均观察到相似的趋势，即风险等位基因-926A相对于保护型等位基因-926T能够使转录降低活性30-50%。在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中，这种差别具有统计学差异。进一步，我们构建了TLR3表达质粒，建立人乳腺癌TLR3稳定转染细胞株，通过体内、体外实验研究观察TLR3对人乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移等生物学行为的影响。并在临床标本中观察TLR3基因的表达