基于QS调控的整合子在食源铜绿假单胞菌生物被膜选择表达机制研究

致病性微生物引起的食源性疾病是全世界头号食品安全问题，不断蔓延的食源细菌耐药性对食品安全构成了巨大的威胁。本项目以常见致病微生物铜绿假单胞菌为研究对象，采用基因扩增及基因定位技术明确三类整合子在食源分离多重耐药菌株中的分布状况、其所整合的耐药基因盒的类型和整合子的基因定位情况；同时，运用基因指纹图谱分型技术揭示该分离菌株生物被膜形成能力与所携带整合子情况的基因相关性规律；并进一步构建群体感应系统重要调控基因遗传子缺陷变异菌株，采用编码整合酶基因表达的定性和定量技术，分析在群体感应系统调控下，整合子在菌株生物膜形成不同时相和状态的选择表达规律及作用机制。本项目可望揭示铜绿假单胞菌整合子介导下耐药基因在生物膜传播和耐药机制的实质，为抑制铜绿假单胞菌耐药性形成、开发控制耐药基因传播的技术手段提供新的思路。

铜绿假单胞菌（PA）在自然界中分布广泛，可通过多种途径传播，是重要的食源性致病菌。该菌常以生物被膜的形式存在，生物被膜的形成提高了其引发食源性疾病的发生率，对人类健康造成了很大的威胁。本研究首先建立改良组织平板培养－结晶紫染色方法对48株食源性PA生物被膜形成能力进行定量分析，结果48株PA中，41株具有生物被膜形成能力，其中弱粘附性和生物被膜形成能力者为15株，中等粘附性和生物被膜形成能力者为19株，强粘附性和生物被膜形成能力者为7株，不具有粘附性和生物被膜形成能力7株。接着应用ERIC-PCR方法对48株PA进行基因分型，结果在17％基因相似水平上PA菌株可被分为A、B、C、D、E 五型，分别包含菌株个数为7、7、10、16和8株；前三个基因型A、B和C包含的菌株生物被膜形成能力相对较弱，D和E基因型的PA具有较强的生物被膜形成能力，菌株生物被膜形成能力和基因型之间具有一定的相关性。采用多重PCR和PCR-RFLP的方法检测7株生物被膜形成能力强的PA整合酶－耐药基因盒的携带情况，结果显示6株PA携带一类整合酶基因，阳性率为85.7％，未发现二类和三类整合酶；其中5株携带耐药基因盒：1株耐药基因盒PCR扩增片段长度为1913bp，2株为2360bp，2株同时扩增出1664bp和1913bp两个片段。采用竞争逆转录一聚合酶链反应技术对该菌I类整合酶基因在以上三种生长状态的mRNA转录水平进行定量分析，发现生物被膜菌的转录水平最高，被膜脱落菌次之，液相浮游菌最低；其中生物被膜菌整合酶基因mRNA的转录水平较液相浮游菌高约15倍，较被膜脱落菌高约4倍。采用实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌整合子与QS系统中lasI/rlhI基因的关系发现PAO1和PA8在培养3、6、9、12h各阶段中lasI和rlhI两基因的表达量均有提高，对lasI而言，PA8在9-12h之间的目的基因表达量是PAO1的3-4.5倍；在rlhI中也有类似结果，9-12h的PA8组比PAO1组高出3-5倍；对于intI1，PA8中，intI1的培养3、6、9、12h里均持续相对较高表达。然而，由于抗生素和细菌之间的作用关系十分复杂，有待于进一步深入的实验来确认。本项目发表的标注论文为11篇，其中SCI收录论文6篇，EI收录论文2篇，申请国家发明专利1项，参加国际会议2次，培养2名研究生和2名本科生.