Gh4CL基因调控咖啡酸衍生物合成影响绿色棉纤维色泽的分子机制研究

Caffeic acid derivatives are synthesized by the phenylpropanoid pathway, and widely present in the plant organs, with a wide range of biological activity. 4-coumarate acyl-CoA ligase (4CL), the last enzyme in the phenylpropanoid main pathway, controls the branching of downstream pathways, where different phenylpropanoid compounds are produced in different directions. In our preliminary studies, several caffeic acid derivatives was isolated and identified in green cotton fiber, but not in white cotton fiber; in addition, the content of these caffeic acid derivatives showed good co-relation with the color of cotton fibers in different varieties of green cotton. These results suggest that caffeic acid derivatives may be key components, which determine green cotton fiber pigment. In the proposed study, we will screen and clone Gh4CL genes, which are specific or predominantly expressed in green cotton fiber. Overexpression and RNAi of Gh4CL genes will be constructed and introduced into green cottons; and comprehensive analysis will be performed on the variation of affeic acid derivative content, fiber color and quality under different expression level of Gh4CL genes in green cotton fiber. To further clarify the molecular and biochemical mechanisms of the pigment formation in green cotton fiber, expression patter,n subcellular localization and enzyme kinetics of the Gh4CLs will be conducted. The proposed study will show the feasibility of using the key gene from caffeic acid derivatives biosynthesis pathway to improve the fiber color and quality of green cotton.

咖啡酸衍生物是由苯丙烷途径合成，广泛存在于植物各器官中，具有多方面的生物活性。4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）是苯丙烷类代谢途径转向下游分支途径的最后一个酶，处在总途径向分支途径的转折点，控制着苯丙烷类代谢向着不同方向进行。在前期研究中，我们从绿色棉纤维中分离到几种色素物质，分析发现它们均属于咖啡酸衍生物，而对应的白色棉纤维中检测不到，结果提示咖啡酸衍生物可能是绿色棉色素的决定成分。本课题拟以绿色棉纤维为材料，克隆和筛选在绿色棉纤维细胞特异或优势表达4CL基因（命名为Gh4CL），构建过表达和RNAi抑制表达载体转化绿色棉，分析Gh4CL基因表达水平的变化与纤维中咖啡酸衍生物含量及纤维色泽、品质的关系；通过对Gh4CL时空表达模式、蛋白亚细胞定位及酶动力学研究，解析绿色棉纤维色素形成的分子和生化机制。本研究将为利用咖啡酸衍生物生物合成关键基因进而遗传改良绿色棉纤维色泽、品质提供理论依据。

苯丙烷代谢途径是植物三大次生代谢途径之一，其代谢产物在植物体中广泛地参与各种生理活动。4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）是苯丙烷类代谢途径转向下游分支途径的最后一个酶，控制着苯丙烷类代谢向着不同方向进行。咖啡酸衍生物是由苯丙烷途径合成，广泛存在于植物各器官中，具有多方面的生物活性。前期研究表明咖啡酸衍生物可能是绿色棉纤维色素形成的主要成分，其随着绿色棉纤维色泽的加深含量逐渐增加。本研究中，我们从绿色棉（陆地棉）中克隆到4个4CL基因（Gh4CL1，Gh4CL2，Gh4CL3，Gh4CL4），均包含一个N-端的保守序列motif I (LP Y/F SSGTTGPKG)和一个C-端的保守序列motif II (GEICIRG)。聚类分析表明Gh4CL1与At4CL1、At4CL2和大豆Gm4CL1等聚为Class II，可能参与黄酮类化合物的生物合成；Gh4CL2，Gh4CL3和Gh4CL4与At4CL1、At4CL2和大豆Gm4CL等聚在Class I中，预示着这两个可能与木质素（纤维中也可能与纤维素）的合成有关。表达分析表明Gh4CL1在纤维中的表达量比较低；而Gh4CL2在绿色棉纤维中的表达量显著高于白色棉纤维中；Gh4CL3在白色棉和绿色棉纤维中的表达量趋于一致；Gh4CL4在白色棉纤维中的表达量显著高于绿色棉纤维中。酶动力学分析表明Gh4CL1的催化效率较低，偏好于4-香豆酸；Gh4CL2对咖啡酸和阿魏酸表现出较高的偏好性，Km分别为26.82 和 28.46 μM。但是 Gh4CL2对4-香豆酸和肉桂酸的催化效率也较低。Gh4CL3和Gh4CL4对底物的催化效率较低，对阿魏酸仍表现出一定的偏好性，Km分别为36.76 μM 和41.83 μM。但是，陆地棉中4个4CL蛋白催化反应中没均未检测到芥子酸相应的酰酯。该研究表明Gh4CL2可能通过调控绿色棉纤维中咖啡酰基衍生物的代谢，进而参与了绿色棉纤维色素的代谢调控。为通过基因工程手段改良绿色棉的纤维色泽奠定了基础。