基于磁性氟氟相互作用的翻译后修饰蛋白质选择性分离富集新技术新方法的研究

Many vital living processes are controlled by post-translational modifications with specific spatial and temporal distributions． Consequently，it is important for comprehending complex biological functions of proteins to reveal the post-translational modification occurrence．Because of the low stoichiometry and broad dynamic range，research on the post-translational modified proteins is still a big technical challenge． Development of novel techniques for separation and enrichment of post-translational modified proteins is extremely urgent． The main purpose of this research is that we aim to develop a novel technique for post-translational modifications enrichment and detection based on fluorous functional magnetic materials. These methodologies rely on fluorine-fluorine interactions between the fluorous modified peptides and the fluorous modified magnetic material. Typically, target proteins with PTMs (such as phosphorylation and glycosylation) are first digested. The modified peptides are then selectively labeled with fluorous tags through chemoselective reactions. After incubation in a minimum amount of organic solvent, the labeled peptides will bind strongly to a fluorous-bonded magnetic microspheres, while the unlabeled compounds remain unbound. After elution, the labled modified peptides are analyzed by LC-MS. Finally the post-translational modified proteins were identified by the analysis of mass spectrometrum. In this way, the fluorous-labeled modified peptides from different modified proteins can be captured at the same time,using the same fluorous modified magnetic material. Therefre, the proposed technique is useful for all the modified proteins.Finally, the proposed technique will be applied to the study of the post-translational modified proteins in liver cancer samples. We expect, new and important post-translational modified protein biomarkers will be found in liver cancer.

蛋白质的翻译后修饰对生物功能的发挥有着至关重要的作用，开展翻译后修饰蛋白质组学研究有重要的科学意义。翻译后修饰蛋白质大多数为中低丰度蛋白，现有的蛋白质组学技术还不能对生物体内的修饰蛋白质进行全面的规模化分析，因此发展翻译后修饰蛋白质的选择性分离富集技术迫在眉睫。本研究拟发展基于磁性氟氟作用的修饰蛋白质分离富集通用型新技术。修饰蛋白（如糖蛋白质和磷酸化蛋白质）酶解得到的修饰肽段经选择性高氟标记后，用亲水性好的固定高氟的磁性碳微球进行高选择性分离富集。从磁碳球上洗脱下来的标记高氟的修饰肽段经色谱质谱分析，最后鉴定修饰蛋白质。不同修饰蛋白质的修饰肽段采用不同的高氟探针进行标记，用相同的固定高氟的磁性微球可以同时进行分离富集，因此该技术是通用性的翻译后修饰蛋白质分离富集新技术。最后，我们把这通用性的分离分析鉴定技术平台将应用于肝癌的修饰蛋白质组学研究中，分析鉴定新的疾病标记的修饰蛋白质。

在国家自然科学基金的支持下，我们开展了基于氟氟相互作用的磷酸化肽/糖基化肽选择性分离富集新技术新方法的研究。高氟烷基修饰的磁性介孔微球被设计及合成，并通过氟氟相互作用被应用于氟相衍生的磷酸化肽的高特异性富集。高氟材料成功地从β-casein酶解液、β-casein酶解液与蛋白的混合溶液和人体血清中选择性富集了氟相衍生的磷酸化肽。这个新型复合材料取得了对于非磷酸化肽摩尔比1:1000的选择性，并被证明对于人血清样品中内源性磷酸化肽的富集同样可行（Proteomics, 2016, 16, 1051-1058）。在糖基化肽段富集研究方面，我们合成了高氟烷基键合的、介孔硅包覆的磁性纳米颗粒，并用于N-糖链的特异性富集。这个基于磁性纳米颗粒的FSPE策略成功从0.5 μg/μL的OVA酶解液中鉴定到22条氟相衍生的N-糖链，并取得了5 ng/μL的检测限（从中检测到16条N-糖链）。这个方法还展示了良好的重复性（不同实验日所得实验结果之间）。该方法所取得的对BSA蛋白的选择性是摩尔比1:200，展现了良好的体积排阻效果。另外，该方法被证明对于人血清酶解液的分析也有效，为生物环境中糖链与蛋白质其它翻译后修饰检测提供了新视角（Talanta, 2016, 159, 111-116）。.此外，我们还开展了功能化磁性石墨烯@聚多巴胺新复合材料固定酶新技术和低丰度肽富集新方法；系统发展了MOF功能化磁性材料的磷酸化肽分离富集新方法；发展了碳修饰的石墨烯介孔硅等新型材料的糖链分离富集新方法；发展了聚苯硼酸的大孔介孔硅复合材料和两性亲水复合纳米材料用于糖肽富集的研究等。研究成果将为大规模蛋白质组学研究提供了很好的样品前处理新技术和新方法。.总的来说，在国家自然科学基金的支持下，本课题在蛋白组学分析样品预处理方面做了大量研究工作，科研成果丰硕。我们在国际核心期刊上发表SCI论文30余篇，包括著名化学与材料期刊 Angew. Chem. Int. Ed. （1篇），蛋白质组学期刊Proteomics（6篇），Chem. Commun. （1篇）等；申请并获授权专利3项，另有两项发明专利已公开；培养了6名硕士研究生，2位博士研究生。.由于出色研究工作， 我们受邀撰写了相关研究的综述发表于 Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 8517-8539