水母毒素β1受体新型肽类配体分子的获取、鉴定及其对β1受体-cAMP-PKA信号通路的激活效应

Acute heart failure is the main reason for human death after jellyfish envenomation, which is the most common marine biological injury. No specific preventive or therapeutic methods or drugs have been developed yet. The exact mechanism of cardiotoxicity is not clear, due to the unsuccessful purification and identification of the specific cardiotoxic component in jellyfish venom. With the support of Youth Science Foundation, we have confirmed that the specific cardiotoxicity was conducted by the over-activation of β1 adrenergic receptor (AR) - cAMP - PKA signaling, based on the second messenger cAMP detection, PKA activity examination, phosphorylated western blot of CERB and cTnI, intracellular Ca2+ screening and inhibitory effects of β1 AR blockers. These results highly signified that jellyfish venom possesses an active peptide ligand of β1 AR contributing to the specific cardiotoxicity. Moreover, our preliminary results from affinity chromatography with the N-terminal 25 amino acids (AA) of β1 AR showed two clear binding protein bands (18 kDa and 20 kDa), directly supporting the existence of peptide ligand of β1 AR in jellyfish venom. In this project, our first aim is to purify and identify the peptide ligand of β1 AR and thus clarify the specific cardiotoxic component in jellyfish venom through a series of steps, including β1 receptor decoy protein synthesis, affinity chromatography, Edman degradation sequencing, LC-MS/MS analysis, sequence alignment and 5'/3'-RACE. In the following, we aim to further synthesize the peptide ligand actively by the method chemical synthesis (≤150 AA) or recombinant expression (>150 AA), which will be used to explore the exact mechanism of the specific cardiotoxicity through β1 AR - cAMP - PKA signaling, Ca2+ homeostasis, isolated heart and intact heart function.

心脏毒性是水母蜇伤致死的主要原因，但其机理不清楚，也无特异性心脏毒性组分成功纯化与鉴定的报道，是目前水母毒素研究的主要瓶颈之一。在青年科学基金的资助下，我们前期已证实水母毒素特异性心脏毒性是由β1受体-cAMP-PKA信号通路介导的，提示水母毒素中可能存在活性强烈的β1受体肽类配体分子，且已开展的亲和纯化预实验有力地支持了该观点。因此，本课题拟通过合成β1受体诱饵蛋白、亲和层析、N末端测序与质谱分析、参考数据库序列比对以及RACE等方法纯化并鉴定1~2种发挥特异性心脏毒性的β1受体新型肽类配体分子，明确水母毒素特异性心脏毒性的物质基础。然后通过化学合成或重组表达的方法大量获得该目标分子，验证其对β1受体-cAMP-PKA信号通路的激活效应，并结合其对心肌细胞Ca2+稳态、离体心脏以及整体动物心脏功能的影响，进一步阐明水母毒素特异性心脏毒性的作用机理，为水母蛰伤的防治提供理论依据和实验基础。

急性循环衰竭是水母蛰伤致死的主要原因，我们在前期大量的研究工作基础提出非特异性细胞毒性和特异性心脏毒性组分共同作用引起心肌细胞Ca2+超载导致急性循环的损伤机制。本项目我们合成了GST-β1受体诱饵蛋白及多肽，但非常遗憾的是未能成功钓取到β1受体的活性多肽类配体分子。对此，我们及时调整研究策略，在水母蛰伤防治方向上我们成功筛选到水母蛰伤新的干预药物Dextran-40，可以在首先静脉注射水母毒素的情况下降低水母蛰伤的小鼠死亡率，为临床上水母蛰伤患者提供了新的干预药物；与此同时，我们还构建了更加符合自然蛰伤状态的水母蛰伤小鼠模型，解决了直接静脉注射水母毒素的模型缺少皮肤对水母毒素的过滤筛选作用的不足，并且通过多脏器多组学联合分析的方式进行水母蛰伤作用机理的探究；此外，我们还在实验室通过2年的努力建立海月水母及其水螅体的饲养、种植与实验室培养与观察体系，构建了饥饿耐受性、辐射损伤、氧化损伤等多个模型，为研究上述条件下的作用机制及干预措施的研究提供了新的思路。在本课题的资助下，先后发表SCI论文7篇，中文文章11篇，授权国家发明专利2项，实用新型专利6项。在人才培养方面，先后培养2名博士研究生，4名硕士研究生。不仅如此，还构建了本科生科研创新团队mECC GOLDEN CLUB开展本课题海洋生物伤防治与海洋生物多样性相关的科研、教学与科普工作，所创立的GOLDEN教学模式被评为海军军医大学教学成果一等奖以及海军优秀教学成果奖。