FBXO7在精子释放过程中的功能研究

10%-15% of childbearing couples facing reproductive problem. Failure of spermiation leads to male infertility. It is remained unclear of regulating factors of apical ectoplasmic specialization (ES) during spermiation. Ubiquitin-26S proteasome system may involve in degradation of ES component. In our human testicular proteomics research, we focus on an E3 ubiquitin ligase component, FBXO7. FBXO7-null male mice were infertile and failure of spermiation, with normal hormone level. Lack of FBXO7 reduced ubiquitination of an ES protein, ESPIN. These results suggested that FBXO7 is an ‘on-off’ of spermiation by protein ubiquitination. We will phenotype conditional knockout of FBXO7 in germ cell and Sertoli cell; look for ubiquitinated substrates of FBXO7-E3 ligase; identify and verify FBXO7 binding protein network. Our study could provide an overall view of FBXO7 in regulation of spermiation.

不孕不育一直是困扰着诸多家庭的严重问题，在育龄夫妻中有10-15%面临不孕不育。精子释放障碍可以导致男性无精子症。然而精子释放过程中顶端ES连接是如何降解并移除的？泛素化依赖的蛋白酶体降解通路可能参与了这一重要的生物学过程。我们前期研究发现FBXO7在睾丸中参与E3泛素连接酶功能。缺失了FBXO7的小鼠，表现出雄性不育，精子无法释放，滞留于生精小管中，激素水平未见异常。缺失了FBXO7后ES连接蛋白ESPIN泛素化水平降低。提示着FBXO7可以作为“开关”分子调控精子释放功能。本课题拟通过分析生殖细胞和Sertoli细胞条件性基因敲除小鼠表型，揭示FBXO7缺失影响的具体环节；筛选和鉴定FBXO7参与SCF复合体E3泛素连接酶的底物及其他共作用蛋白，从而全面阐明FBXO7在精子释放过程中发挥的调控作用。

精子发生是一个高度复杂的生物学过程，主要包含三个部分：精原干细胞增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子细胞的变性，并最终形成流线型精子，释放到管腔中，其中成熟精子在进入附睾前从睾丸支持细胞处释放到生精小管管腔的过程称为精子释放。精子释放结束时，精子细胞的离开生精上皮进入管腔中央，分离的胞质形成残余小体被Sertoli细胞所吞噬。顶端ES连接是精子释放的结构基础，它是由内质网、Sertoli细胞膜以及由Espin等多种蛋白质参与组装的六聚体微丝束组成。顶端ES结构的解聚是为精子细胞释放到管腔作准备，但是在精子释放过程中，调控顶端ES组分解聚的机制尚未被阐明。.在本研究中，我们通过睾丸网微注射将泛素化通路抑制剂MG-132注射到小鼠生精小管，发现精子释放的过程受到显著影响。通过免疫荧光和Weatern Blot对ES连接各组分进行了观察，我们发现实验组Espin蛋白水平升高；通过在小鼠睾丸中过表达Espin后研究发现，过表达Espin后可以导致精子释放障碍，并且过表达的Espin融合蛋白与內源的Espin蛋白定位相同，主要定位于ES连接处。进而通过Co-IP实验，我们发现FBXO7、RMND5B、NOSIP等E3泛素连接酶与Espin相互作用。通过基因敲除小鼠研究，发现RMND5B敲除后不会对精子释放产生影响；FBXO7敲除后会出现与Espin过表达相似的表型，精子释放障碍。.通过免疫电镜，我们发现FBXO7定位于顶端ES连接的F-actin束状结构；并且免疫荧光结果显示FBXO7在精子释放初期定位于长形精子的胞质中，随着管球复合体开始出现，FBXO7逐渐与TBC结构共定位，随后FBXO7信号定位在Sertoli细胞侧的ES连接处；同时发现FBXO7与内体标志物EEA1共定位，提示FBXO7通过TBC进入Sertoli细胞发挥功能。通过细胞系过表达FBXO7，发现Espin随着FBXO7的表达稳定性降低，同时其多聚泛素化水平明显增高。这些结果阐明精子释放过程受泛素化依赖的顶端ES结构解聚过程调节，同时是生殖细胞和体细胞共同作用的一个生物学过程。