αA 晶状体蛋白对视网膜保护作用的机制及其对干性年龄相关性黄斑变性的治疗研究

干性年龄相关性黄斑变性是导致不可逆盲的重要原因之一，其发病机制目前认为是在氧化应激作用下视网膜细胞变性。αA 晶状体蛋白有很强的分子伴侣活性，能够保护细胞免受氧化应激的影响。我们在预实验中进一步发现了αA 晶状体蛋白对视网膜有很强的保护作用，它是连接氧化应激与AKT（细胞增殖、存活）和PPARγ（抗氧化应激）的关键中间因子（属首次发现，目前国际上尚无相关报道）。本项研究计划将深入研究αA晶状体蛋白抗氧化应激的分子生物学基础，并且进一步探讨该蛋白质对老年性黄斑变性的预防与治疗作用。本项目的成功实施可能发现调控老年黄斑变性的一条新途径，不仅有助于加深对该病的认识，更为该病的临床治疗提供了重要新方法。

目的：年龄相关性黄斑变性是目前全球主要的致盲性疾病。干性年龄相关性黄斑变性（Dry AMD）占了AMD的80-90%。αA晶状体蛋白（CRYAA）既是一种分子伴侣也是一种热休克蛋白，在小鼠的视网膜中表达。在这个研究主要探讨CRYAA在视网膜中对抗氧化应激的保护效应和其在体内和体外保护视网膜的可能机制。 方法: 使用人类视网膜色素上皮细胞（RPE）D407细胞株作体外实验 ，129S6 /SvEvTac小鼠作体内实验。敲除和不敲除RPE 细胞里的αA晶状体蛋白，验证碘酸钠(NaIO3)是否诱导氧化应激。用carboxy-DCF2DA探针在荧光显微镜下观察活性样自由基 (ROS) 。体外实验，流式细胞仪进行Annexin V/PI双染检测和TUNEL染色来检测细胞凋亡。Western Blot检测AKT及 PPARγ 信号通路。在体内，尾静脉注射20 mg/kg碘酸钠制作小鼠的氧化应激模型。小鼠行ERG检查观察视网膜的功能。后眼球作冰冻切片、H&E染色，分别观察视网膜的功能学和组织学形态。 结果: 碘酸钠处理加速和增强了CRYAA基因敲除小鼠的视网膜变性。这个实验也研究了碘酸钠在氧化应激机制里扮演的角色，以及CRYAA在这个过程里的调节角色。在碘酸钠处理后，RPE细胞中的ROS增加。低剂量碘酸钠处理后,转染CRYAA小分子RNA（siRNA）的RPE细胞的凋亡比阴性对照组增加。碘酸钠诱导CRYAA基因敲除小鼠RPE细胞中磷酸化的PDK1、AKT、GSK3beta上调。被100μg/ml NaIO3处理后，PPARγ增加了。敲减αA-晶状体蛋白的RPE细胞中，PPARγ蛋白表达的增加比RPE细胞少。碘酸钠处理的CRYAA基因敲除小鼠比起野生型小鼠的视网膜变性更加严重，ERG示意a波和b波都下降。 结论: 资料显示CRYAA 在碘酸钠诱导的氧化应激在视网膜变性中扮演很重要的角色，磷酸化PDK1和PPARγ的上调可能参与其氧化应激机制。我们发现αA-晶状体蛋白对视网膜有很强的保护作用，它是连接氧化应激与 AKT (细胞增殖、存活)和 PPARγ(抗氧化应激)的关键中间因子(属首次发现,目前国际上尚无相关报道)。本项研究计划深入研究αA 晶状体蛋白抗氧化应激的分子生物学基础,并且进一步探讨该蛋白质对老年性黄斑变性的保护作用。本项目的成功实施可能发现调控老年黄斑变性的一条新途径。