间充质干细胞克隆清除诱导移植耐受新机制研究

前期研究发现嵌合体通过克隆清除机制诱导移植耐受，外源效应性T细胞破坏耐受小鼠外周血细胞嵌合体，低剂量组小鼠仍长期耐受移植物，高剂量组小鼠排斥移植物，自体重新产生同种异体反应性T细胞。基于上述实验提出的间充质干细胞嵌合体理论假说认为：存在于中枢免疫器官的供体间充质干细胞参与效应性T细胞的阴性选择，同种异体反应性T细胞的克隆清除形成移植耐受，间充质干细胞通过克隆清除机制而非免疫调节机制诱导移植耐受。GFP小鼠脾脏细胞或间充质干细胞移植建立移植耐受动物模型，通过分析耐受小鼠不同部位、不同细胞嵌合体与移植耐受的关系，间充质干细胞诱导的移植耐受是否具有特异性等研究同种异体反应性T细胞克隆清除、移植耐受的机制，验证间充质干细胞嵌合体理论假说的正确性。改变中枢免疫器官间充质干细胞嵌合体可改变机体的耐受状态，如果该假说得以验证，对实现器官移植完全耐受和自身免疫病的彻底治愈具有重要理论价值和指导意义。

深入探讨免疫耐受机制不仅具有重要理论价值，也有助于现实移植器官长期耐受和自身免疫病的彻底治愈。前期工作显示，移植耐受依赖嵌合体的形成。间充质干细胞具有免疫调节、多向分化潜能，可抑制移植排斥反应，移植耐受是否与间充质干细胞嵌合体有关尚待进一步研究。本项目以体外纯化培养获得的骨髓来源间充质干细胞，短期培养获得的贴壁、非贴壁骨髓细胞，分选的CD45+ 骨髓细胞诱导新生期和成年小鼠移植耐受，排除间充质干细胞诱导长期移植耐受的可能性，CD45- 非贴壁骨髓细胞可能与耐受有关。进而，我们以实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型（EAE）为对象，探讨机体对“自己”、“非己”抗原的不同反应性，研究自身免疫耐受机制。通过动态观察、对比分析髓鞘蛋白和卵清蛋白刺激后，T细胞在胸腺的发育，在脾脏、淋巴结的活化、凋亡与迁移，并通过体内转移实验，研究抗原对T细胞迁移的作用，提出，“自己”和“非己”抗原均有免疫原性，可诱导免疫应答。效应性T细胞具有向靶抗原、靶器官定向迁移的特性。卵清蛋白反应性T细胞主要存在于脾脏、淋巴结；EAE发病前，少量激活的髓鞘蛋白反应性T细胞可迁移至中枢神经系统诱导慢性炎症，随脾脏、淋巴结内外源性髓鞘蛋白的清除和慢性炎症引起的中枢神经系统髓鞘蛋白暴露增加，大量髓鞘蛋白反应性T细胞迁移至中枢神经系统引起自身免疫病；中枢神经系统外，外源性髓鞘蛋白暴露增加（髓鞘蛋白治疗或免疫接种部位髓鞘蛋白释放增加）可抑制髓鞘蛋白反应性T细胞向中枢神经系统迁移，预防和治疗EAE。正常情况下，自身抗原反应性T细胞在体内长期存在，但不能引起自身免疫病。T细胞的不同功能亚群与免疫自稳、免疫监视功能有关。通过分析中枢记忆性T细胞和效应记忆性T细胞的功能与粘附分子表达，筛查参与T细胞分化与迁移的关键分子，体内评估其在细胞迁移中的作用。研究发现，Gr-1是小鼠中枢记忆性CD3+CD8+CD62L+CD44+ T细胞的特异性表面标志。抗原刺激后，CD3+CD8+Gr-1+ 细胞可增殖，分化为杀伤细胞，Gr-1丢失；在免疫反应的末期，部分杀伤细胞又可转化为CD3+CD8+Gr-1+ 细胞，细胞不具有杀伤功能；Gr-1参与CD3+CD8+Gr-1+ 细胞向脾脏、淋巴结迁移，抗体封闭Gr-1分子可抑制其迁移。CD3+CD8+ T 细胞通过调控Gr-1表达，在免疫耐受、免疫防御中发挥重要作用。