SirT1在Acetaminophen诱发的药物性肝损伤中的作用及机制

SirT1是一种NAD＋依赖的去乙酰化酶，在细胞的抗氧化应激和延缓衰老等方面发挥重要的作用。Acetaminophen（APAP）是目前广泛用于解热镇痛的OTC药，该药的不当使用会诱发严重的肝损伤。我们在前期工作中发现，在APAP诱发的肝细胞损伤过程中，SirT1的蛋白表达显著上调，提示SirT1在APAP诱发的肝损伤中起着重要的调节作用。本项目拟运用细胞生物学和分子生物学的手段，从体外和体内两个方面来研究SirT1在APAP诱发肝细胞损伤中的作用和机制。本研究拟从以下四个方面开展：1.SirT1对APAP诱发肝细胞凋亡的影响及机制；2.SirT1对APAP诱发肝细胞氧化损伤的影响及机制；3.SirT1对APAP代谢酶CYP2E1的调控作用；4.在APAP诱发肝损伤中，SirT1蛋白表达上调的机制。本研究为以SirT1为基因靶点进行药物治疗和筛选治疗APAP诱发肝损伤的药物奠定了理论基础。

SirT1 是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶。SirT1参与多种生理和病理过程的调节，如抗氧化应激、能量代谢、抗细胞衰老、抑制细胞凋亡，参与肿瘤的发生发展。对乙酰氨基酚（Acetaminophen），通常在治疗剂量范围内是安全有效的，但是APAP的过量服用会诱发严重的肝损伤，甚至死亡。通过该课题的研究我们发现，在培养的肝细胞LO2和HepG2中，APAP能够诱导SirT1 mRNA和蛋白的表达增加。同样，在小鼠动物模型中，APAP也能够诱导SirT1蛋白表达水平的增加。在肝细胞LO2中敲降SirT1的表达，能够增强APAP抑制LO2的存活，同时降低细胞内GSH的含量。通过尾静脉注射携带SirT1 shRNA的慢病毒，敲降小鼠肝组织内SirT1的表达，HE染色表明，与对照相比，敲降SirT1后，加剧APAP对肝组织的损伤。以上这些研究结果表明，SirT1在APAP诱发的肝损伤中具有保护作用。随后，我们研究APAP诱导SirT1表达的分子机制。我们分别构建SirT1的启动子和3’ UTR报告基因质粒。非常有意思的是，我们发现APAP能够诱导SirT1 3’ UTR报告基因的活性，而对SirT1的启动子报告基因的活性没有影响。miRNA是长度在19-25个核苷酸短链非编码RNA分子，在转录后水平通过基因的3’ UTR区起调控作用。已有的文献报道，APAP能够改变肝组织内miRNA表达谱，生物信息学预测表明，其中miR-29b，30a，122,132,194,212,19b可能调控SirT1的表达，随后，我们逐一突变，这些miRNAs调控的潜在位点。结果显示，突变miR-19b潜在的调控位点后，阻碍APAP对SirT1 3’ UTR报告基因的活性诱导作用。Western实验表明，在LO2细胞中过表达miR-19b抑制APAP对SirT1的诱导作用。这些结果表明，APAP诱导SirT1的表达，主要通过调控miR-19b来实现的。总之，通过本项目的研究我们发现，APAP诱导的SirT1在APAP诱发的肝损伤中具有重要的保护作用，APAP诱导的SirT1与miR-19b密切相关。