用作DNA疫苗载体的壳聚糖季铵盐纳微球的新型制备方法及应用研究

目前DNA 疫苗微球给药体系存在微球粒径不均一、大小难控制、反应条件剧烈、易损害疫苗活性、难以定量研究微球粒径与免疫效果间关系等问题。本研究拟将具有临界温度-相转变特性的温敏材料与微孔膜乳化法结合，制备用作DNA疫苗载体的壳聚糖季铵盐纳微球。具体思路为：将温敏性的壳聚糖季铵盐-甘油磷酸盐-聚乙二醇体系与DNA疫苗混合，并压过膜孔进入含乳化剂的油相，利用分散相与膜的高界面张力得到均一乳液滴，再将液滴在37度下固化得到粒径均一的载DNA微球。还将发展新的快速膜乳化法制备纳米级载DNA微球。将考察水相组成、油水相比例等对微球特性、疫苗活性、载药量及释放行为的影响。本研究利用温敏材料和温和的膜乳化制球过程避免了原来的壳聚糖弱酸溶液、剧烈搅拌以及化学交联法等会使DNA失活的问题；利用粒径均一性可定量研究微球粒径对免疫效果的影响，获得理想的DNA疫苗载体。本研究还能为其他温度敏感材料的功能化提供思路。

针对目前DNA 疫苗微球给药体系存在微球粒径不均一、大小难控制、反应条件剧烈、易损害疫苗活性等问题，本研究将具有临界温度-相转变特性的壳聚糖季铵盐温敏凝胶与微孔膜乳化法结合，制备粒径均一的壳聚糖季铵盐纳微球（凝胶微球）。通过对壳聚糖季铵盐制备条件、膜乳化条件的优化，得到了不同粒径、季铵取代度的凝胶微球，并对纳微球的粒径分布、形貌进行了表征。同时还制备了化学交联的壳聚糖季铵盐纳微球（化学交联微球），以研究不同制备方法对后续疫苗负载、免疫效果的影响。细胞实验和动物实验结果表明，本项目所设计的凝胶微球可以实现较高的抗原负载率，保护DNA不被降解，有效转染细胞，并取得高于铝佐剂、细菌脂多糖及化学交联微球的免疫增强效果。通过对凝胶微球的作用机制进行系统分析，其免疫增强作用主要归因于以下几个方面：（1）凝胶微球在注射部位形成抗原贮库效应，延长抗原停留时间；（2）募集炎症细胞，增强抗原与免疫细胞的相互作用；（3）凝胶微球促进抗原被树突细胞摄取，并促进抗原从溶酶体逃逸到细胞质；（4）有效激活树突细胞，促进抗原提呈。本项目所制备的凝胶微球有望作为一种普适的疫苗载体，用于不同类型疫苗的免疫。