典型抗菌素酶催化、降解菌蛋白质组表达与代谢网络调控的耦合机制

Triclocarban is a typical broad-spectrum microbicide with the properties of persistence, gene toxicity and endocrine disruption. It can be degraded through a series of chemical reactions, including dechlorination, deamination, hydroxylation and benzene-ring cleavage. Cellular genome regulation, proteome expression, enzyme activation, reaction catalysis and molecular signal transduction are involved in this process. To reveal these involved mechanisms during the triclocarban degradation process by Bacillus thuringiensis at the catalytic reaction and molecular network levels, the dynamic interactions among triclocarban degradation, proteome expression and metabolic network regulation will be investigated using mass spectrometry analysis, and genomic, proteomic, metabolomic and bioinformatic methods in this project. To clarify the catalytic mechanisms of the triclocarban biodegradation, gene expression, protein separation, CRISPR/Cas9 gene knockout and molecular recognition approaches will be used to reveal functions of enzymes for triclocarban degradation. The project will present new insight into bioremediation of polluted environments with microbicides. The approach for selecting biomarkers, and the omics method for studying the metabolic network related to pollutant biodegradation will be developed.

三氯卡班是典型的广谱抗菌素，具有持久性、基因毒性和内分泌干扰性。其微生物降解包括脱氯、脱胺、羟基化和苯环断裂等反应，涉及降解菌基因组调控、蛋白质组表达、酶原激活、酶催化和分子信号传导等科学机制。为了在催化反应和分子网络层面系统地揭示上述机制，本项目将以苏云金芽孢杆菌为功能菌种，耦合降解产物质谱分析、基因组学、蛋白质组学、代谢组学和生物信息学的方法体系，研究三氯卡班降解、蛋白质组表达和代谢网络调控的耦合机制，揭示三氯卡班降解途径、代谢网络、分子标志物组和功能蛋白质互作网络；采用基因克隆、降解酶分离、CRISPR/Cas9多基因敲除和课题组原创的分子识别电泳技术进行降解酶功能验证，剖析三氯卡班的酶催化机制和特异性代谢途径，为指导抗菌素污染环境的生物修复提供调控理论。项目的实施有望创新性地建立生物分子标志物组的大数据挖掘方法，以及建立研究污染物生物降解与代谢网络调控的分子组学方法体系。

三氯卡班是典型的广谱抗菌素，具有持久性、基因毒性和内分泌干扰性，被认为是十大新型污染物之一。根据其分子结构，三氯卡班的微生物降解包括了脱氯、脱胺、羟基化和苯环开环等系列反应，涉及功能微生物基因组调控、蛋白质组表达、酶原激活、酶催化和分子信号传递等分子组学机制。为了在分子水平、代谢网络层面和生化反应本质上揭示上述机制，本项目利用基因组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学方法，研究了三氯卡班降解和胁迫过程，三氯卡班的降解途径、代谢标志物和代谢网络。结果表明，三氯卡班微生物降解始于脲桥的断裂，生成4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺中间产物。4-氯苯胺可在加氧酶的作用下脱胺基并羟基化，转化为4-氯邻苯二酚，苯环开环后生成5-氯-2-羟基己二烯二酸半醛和3-氯-cis,cis-己二烯二酸；而3,4-二氯苯胺则通过脱氯的方式进入4-氯苯胺的降解途径。糖转运磷转移酶系统、糖酵解、TCA循环、磷酸戊糖途径、NAD+合成、次生代谢产物合成等途径参与了三氯卡班降解过程。6,7-二甲基-8-核黄素合酶(RibE)、核黄素合酶(RibC)上调了核黄素的合成通道。醇脱氢酶(AdhP)、NADH脱氢酶(WrbA)、NAD+合成酶(NadE)增强了NAD+的合成和再生。P450 酶系由含有黄素腺嘌呤二核苷酸的铁氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白以及细胞色素P450三个独立的蛋白质组成。NADH是该酶系的电子供体，核黄素是P450 酶催化的关键因素。NADH和核黄素的合成上调，加速了三氯卡班的酶催化。本项目的实施建立了研究污染物生物转化代谢网络的系统生物组学方法体系。研究成果有效地丰富了现有生物信息学数据库，为指导抗菌剂污染环境的生物修复提供理论依据和技术支持。项目成果发表SCI论文11篇，中文核心论文1篇；申请发明专利1项，获实用新型专利授权1项；培养青年教师4名和硕士生7名。